滕艷杰 安錦丹 陳培 楊曉帆 王莞 趙洪濤

異丙腎上腺素為β受體激動(dòng)劑，有強(qiáng)烈的刺激唾液腺腫大的作用[1-4]。多次反復(fù)注射引起唾液腺的增生和肥大。腫大的腺體可以作為體內(nèi)腺體增生和肥大的模型進(jìn)行研究，因?yàn)槠湓錾头蚀蟮臋C(jī)制還沒(méi)有完全明了。筆者的前期工作研究表明，異丙腎上腺素引起的腮腺腫大可能與細(xì)胞因子TNF-α與IL-1β的增多有關(guān)[5]，現(xiàn)進(jìn)一步明確其關(guān)系。

益賽普為注射用重組人腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白，能競(jìng)爭(zhēng)性地與血中TNF-α結(jié)合，阻斷它和細(xì)胞表面TNF-α受體結(jié)合，降低其活性[6]。在本研究中，在用異丙腎上腺素引起小鼠唾液腺腫大的同時(shí)，給以益賽普TNF-α受體拮抗劑，觀察其對(duì)腺體腫大的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 （1）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：體重34～42 g的SPF級(jí)昆明小鼠，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。（2）主要藥品與試劑：注射用重組人腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白（益賽普）（上海中信國(guó)建藥業(yè)有限公司）；小鼠細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒（美國(guó)Biosource公司）；兔抗小鼠多克隆抗體試劑盒（北京百奧博奧森生物技術(shù)有限公司）；其他生化試劑購(gòu)于Sigma公司。（3）儀器：Model 550 Microplate Reader （美國(guó)Bio-Rad公司）。Nikon1200型顯微鏡圖像采集系統(tǒng)（日本Nikon公司）

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物模型制備與實(shí)驗(yàn)分組 適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，21只8周雄性昆明小鼠隨機(jī)分為三組：對(duì)照組、異丙腎上腺素組（IPR組）、益賽普組。后兩組每天晚上（18：00）腹腔注射IPR（30 mg/kg），一共注射6次。益賽普組于第1次注射及第4次注射前2 h皮下注射益賽普（15 mg/kg），對(duì)照組、IPR組注射同等體積的生理鹽水。動(dòng)物自由飲水、進(jìn)食，第7天處死，處死前絕食12 h，自由飲水。

1.2.2 標(biāo)本收集及處理 小鼠斷頭放血處死。迅速取出腮腺，除去淋巴結(jié)、脂肪、結(jié)締組織及包膜，一部分在液氮罐中保存?zhèn)溆谩Ｒ徊糠秩俳M織浸入4%多聚甲醛固定后常規(guī)石蠟包埋，切片待檢。酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)腮腺組織中的腫瘤壞死因子-α及白細(xì)胞介素-1β，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.2.3 腮腺組織病理學(xué)觀察 各組小鼠腮腺組織石蠟切片分別行蘇木素-伊紅（HE）染色觀察小鼠腮腺組織一般病理學(xué)改變，用Nikon1200顯微圖像采集系統(tǒng)，200倍視野觀察。

1.2.4 免疫組化檢測(cè)TNF-α和IL-1β的表達(dá) 取包埋好切片，按試劑盒說(shuō)明書步驟進(jìn)行，兔抗小鼠TNF-α和IL-1β多克隆抗體稀釋度為（1：100），DAB顯色，蘇木素輕度復(fù)染核，光鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 11.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)；所有的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均采用雙側(cè)檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 組織病理學(xué)觀察結(jié)果 小鼠連續(xù)注射IPR 6 d后，第7天取出腮腺，與對(duì)照組比較，明顯腫大；益賽普組腮腺也腫大，但與IPR組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（數(shù)值略）。HE染色結(jié)果：對(duì)照組腮腺組織結(jié)構(gòu)正常，由分泌部和導(dǎo)管組成，分泌部為漿液腺泡，腺泡細(xì)胞及導(dǎo)管包膜完整，形態(tài)正常，邊界整齊；IPR組小鼠與對(duì)照組對(duì)比有明顯組織學(xué)改變，表現(xiàn)為腺泡細(xì)胞不同程度的腫脹，間隙變小，腺組織趨于增多，結(jié)締組織成分相對(duì)減少，導(dǎo)管未見(jiàn)明顯增生。益賽普治療組與IPR組相比，沒(méi)有明顯的組織學(xué)改變（圖1）。

圖1 各組腮腺組織病理學(xué)觀察結(jié)果（HE染色，×200）

2.2 腮腺組織中TNF-α和IL-1β的表達(dá) 對(duì)照組腮腺組織TNF-α和IL-1β幾乎不表達(dá)；IPR組在腺泡細(xì)胞有表達(dá)，且表達(dá)絕大部分近基底部；益賽普治療組表達(dá)部位雖與IPR組相似，但陽(yáng)性強(qiáng)度較明顯減少（圖2）。

圖2-1 各組腮腺組織中TNF-α的表達(dá)（DAB顯色，×200）

圖2-2 各組腮腺組織中IL-1β的表達(dá)（DAB顯色，×200）

2.3 ELISA檢測(cè)結(jié)果 各組腮腺中TNF-α和IL-1β指標(biāo)的比較見(jiàn)表1。

表1 各組腮腺中TNF-α和IL-1β指標(biāo)的比較（±s）ng/（mg·ml）

表1 各組腮腺中TNF-α和IL-1β指標(biāo)的比較（±s）ng/（mg·ml）

*與對(duì)照組比較，P<0.001；△與IPR組比較，P<0.05

組別 TNF-α IL-1β對(duì)照組（n=7） 1.120±0.204 1.904±0.148 IPR組（n=7） 6.861±0.703* 6.586±0.456*治療組（n=7） 5.843±0.541△ 5.827±0.576△

3 討論

異丙腎上腺素是非選擇性β受體激動(dòng)劑，慢性注射可引起腮腺的增生和肥大，包括重量增多和DNA、RNA和蛋白質(zhì)合成都增多。腮腺的腫大也可以通過(guò)注射生長(zhǎng)因子如表皮生長(zhǎng)因子或飲食的改變而出現(xiàn)[7]。除掉處理因素，腫大的腮腺能夠恢復(fù)正常。腮腺腫大后，唾液分泌增多，所以慢性IPR注射可以用來(lái)研究唾液腺的分泌機(jī)制及腫大機(jī)制。

有報(bào)道細(xì)胞因子TNF-α信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是肝細(xì)胞增生的始動(dòng)因子[8]，在口腔干燥綜合征患者腮腺腺上皮細(xì)胞TNF-α和IL-1β的mRNA表達(dá)高出正常水平幾十倍，筆者的前期的工作發(fā)現(xiàn)由IPR誘導(dǎo)的大鼠腫大腮腺組織TNF-α和IL-1β的蛋白質(zhì)及mRNA均增多表達(dá)，本次實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖沁M(jìn)一步驗(yàn)證TNF-α和IL-1β和腫大的關(guān)系。

本實(shí)驗(yàn)在給予IPR注射的同時(shí)，給以其可溶性受體拮抗劑，從組織學(xué)角度來(lái)看，益賽普沒(méi)有明顯改變IPR引起的腮腺的增生和肥大，盡管益賽普組腮腺組織內(nèi)TNF-α和IL-1β的蛋白表達(dá)與IPR組相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的減少。免疫組化結(jié)果也顯示益賽普干預(yù)治療組與IPR組相比較，TNF-α和IL-1β的表達(dá)量有所減少。

綜上所述，益賽普可溶性TNF-α抗體雖然可以減少IPR所致的小鼠腮腺組織內(nèi)TNF-α和IL-1β的蛋白表達(dá)，但TNF-α和IL-1β的減少并不能減輕IPR引起的腮腺腫大。

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