胡慧，臧鞏固，趙立寧，李育君，唐蜻，程超華，高春生

(中國農(nóng)業(yè)科學院麻類研究所，湖南長沙410205)

整體透明技術(shù)指的是用各種不同配比的透明劑來處理植物組織，處理后的材料中各個器官由于組成、顏色和厚度等存在差別，從而對光線的折射率不同，在微分干涉差(differential interference contrast，DIC)顯微鏡或相差顯微鏡下可以直接觀察組織內(nèi)部結(jié)構(gòu)的方法。在植物胚胎學的研究中，與傳統(tǒng)的石蠟切片法相比存在顯著的優(yōu)勢，簡單易行，大大地節(jié)省了進行胚胎觀察的時間;目前經(jīng)許多專家與學者的不斷完善，已成為植物學教學與科研中的一項重要技術(shù)，常被用于花粉、胚囊、胚、種子和果實等形態(tài)、結(jié)構(gòu)和發(fā)育生物學研究［2，4］。

在使用整體透明技術(shù)對懸鈴葉苧麻胚胎發(fā)育的觀察研究中，李彥坤等使用傳統(tǒng)的透明方法，對其固定液與透明劑的選擇進行了一定的摸索，得出卡諾1固定液(甲醇:冰醋酸=3:1)配合冬青油的觀察效果較好;在此基礎(chǔ)上我們試驗發(fā)現(xiàn)直接對胚珠進行透明的觀察效果更佳，本試驗對提取胚珠的方法進行了一定的探究，確定了酶解法提取懸鈴葉苧麻雌花的胚珠［1，3］，并試驗不同比例的酶組合以找出適宜的分離方法;同時針對直接透明的材料在鏡下反差小、不易觀察的問題，試驗中采用對胚珠進行整體染色后再透明的方法，并比較了幾種不同透明方法的觀察效果，旨在找出最佳的透明方法，以提高整體透明技術(shù)在懸鈴葉苧麻胚胎發(fā)育觀察中的效果［2－15］。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗選用中國農(nóng)業(yè)科學院麻類研究所收集并保存的懸鈴葉苧麻(Boehmeria tricuspis)，取開花期的雌花序作為試驗材料。所用化學試劑為分析純，用水為去離子水，觀察用顯微鏡為北京泰克立體顯微鏡XTL－20和Olympus微分干涉差顯微鏡BX51TRF。

1.2 試驗方法

1.2.1 固定

對開花期的懸鈴葉苧麻雌花定期取材，取材后立即將新鮮的雌花固定于卡諾固定液中，每隔3－4個小時更換固定液，換液兩次，最后一次固定24小時以上，后換入75%乙醇中，于4℃冰箱保存。

1.2.2 解離

將貯存的懸鈴葉苧麻雌花依次經(jīng)50%、30%乙醇下行至蒸餾水，在水中換洗數(shù)次，最好過夜，以徹底脫去乙醇。然后取懸鈴葉苧麻雌花置于預裝解離液的10ml離心管中，在30℃左右的保溫條件下連續(xù)振動約5小時，以便促使酶解作用充分進行。試驗過程中每組處理的雌花生長大小、酶液體積等條件基本相同。

為比較不同離解方法的離解效果，分別作了以下幾組處理:

a不同離解液效果比較:離解液1:鹽酸液(濃度:1mol/L);離解液2:果膠酶液(濃度:2%);離解液3:纖維素酶液(濃度:2%);CK:純水;

b單一酶液與混合酶液效果比較:酶液1:纖維素酶液(濃度:2%);

酶液2:纖維素酶液+果膠酶液(濃度:2%+2%);

c纖維素酶液不同濃度效果比較:濃度1:1%;濃度2:2%;濃度3:3%;濃度4:5%;

c混合酶液不同濃度組合效果比較:組合1:纖維素酶液(3%)+果膠酶液(1%);組合2:纖維素酶液(3%)+果膠酶液(2%);組合3:纖維素酶液(3%)+果膠酶液(3%);組合4:纖維素酶液(5%)+果膠酶液(5%);CK:纖維素酶液(3%)。

1.2.3 觀察與統(tǒng)計

將含材料的離解液加蒸餾水稀釋，略加靜置，用吸管棄去上清液，再換水重復1—2次。置于解剖鏡下觀察計數(shù)，隨機觀察500個雌花，統(tǒng)計解離出的胚珠數(shù)所占的比例。

1.2.4 整體透明

將含材料的酶液(未進行計數(shù))加蒸餾水稀釋，在離心機中以2000轉(zhuǎn)/分的速度離心約5分鐘，用吸管棄去上清液，再換水重復離心2—3次。分別進行后續(xù)透明處理:

a蘇木精染色－冬青油透明

染色:用愛氏或梅氏蘇木精明礬染色液染色數(shù)小時。

脫水:將材料依次轉(zhuǎn)入雙蒸水、10%乙醇、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇進行逐級脫水，每次脫水10～20分鐘。最后轉(zhuǎn)入無水乙醇徹底脫水，中間換液2次，每次1小時。

透明:將完全脫水后的材料轉(zhuǎn)入無水乙醇與冬青油等體積混合液中進行過渡，中間換液2—3次，每次時間l小時。然后經(jīng)純冬青油透明，中間換液2—3次，最后一次透明24小時以上。

b乳酚甘油透明

材料經(jīng)酶解水洗后直接置入乳酚甘油中數(shù)小時，并加入丙酸洋紅染色。

c乳酸預處理－冬青油透明

材料置入乳酸中于50℃下處理24小時，轉(zhuǎn)入無水乙醇中進行過渡，中間換液2—3次，每次一小時，然后轉(zhuǎn)入無水乙醇與冬青油等體積混合液中，最后用純冬青油進行透明，具體步驟同a的透明過程。

d 84消毒液

材料經(jīng)酶解或不經(jīng)酶解直接放入盛有84消毒液的小稱量瓶中，蓋上蓋子進行浸泡20～30 m in，觀察其顏色由深變淺，由不透明變較透明時，即完成透明處理。如需染色，須先在自來水中清洗數(shù)遍。

1.2.5 顯微觀察

將透明好的材料連同透明劑轉(zhuǎn)移到載玻片上，加蓋玻片封存，在微分干涉差顯微鏡下觀察胚珠透明情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同離解液的效果比較

分別用鹽酸、果膠酶液、纖維素酶液處理懸鈴葉苧麻雌花后，在解剖鏡下隨機觀察500個雌花，記錄分離出的胚珠的數(shù)目。重復試驗三次，結(jié)果見表1。

表1 不同離解液的解離效果Tab.1 Results of different dissociative solutions

在觀察中，我們發(fā)現(xiàn)在同樣的外部條件和時間下，2%纖維素酶液的解離效果最明顯，能清晰地觀察到脫去外皮的胚珠，且接近50%的胚珠被分離出來;而在2%果膠酶液的處理下，雖然也能明顯地看到雌花被解離了，也去掉了部分外包被，但基本上沒有解離出達到標準的胚珠(即1/2以上的胚珠暴露出來);1mol/L鹽酸處理下分離出的胚珠數(shù)與果膠酶液處理下分離出的數(shù)目相當，但未分離出胚珠的雌花大多只是除去了最外層的毛，外包被相較而言比較完整。

圖1 不同離解液的解離效果Fig.1 Results of different dissociative solutions

2.2 單一酶液與混合酶液的離解效果比較

分別用混合酶液(2%纖維素酶+2%果膠酶)與2%纖維素酶液處理懸鈴葉苧麻雌花，觀察與記錄同上。重復試驗三次，結(jié)果見表2。

處理方法觀察的雌花

表2 單一酶液與混合酶液的解離效果Tab.2 Comparison between single enzyme solution and mixed enzymes solution

從表2可以看出混合酶液的解離效果比單一的2%纖維素酶液的解離效果好。

2.3 不同濃度的纖維素酶液離解效果比較

分別用不同濃度的纖維素酶液處理懸鈴葉苧麻雌花，觀察與記錄同上。重復試驗三次，結(jié)果見表3。

表3 不同濃度纖維素酶液的解離效果Tab.3 Dissociation results of different concentrations of cellulase

從表3可以看出隨著纖維素酶液的濃度增大，解離效果先增高，后又降低，比較而言3%纖維素酶液的解離效果最好。

2.4 最適混合液篩選

分別用不同濃度的果膠酶液和3%纖維素酶液組合處理懸鈴葉苧麻雌花，觀察與記錄同上。重復試驗三次，結(jié)果見表4。

表4 不同混合液的解離效果Tab.4 Dissociation results of the mixed solutions

從表4可以看出隨著果膠酶液濃度增大，解離效果逐漸降低，而與對照組單獨的3%纖維素酶液的解離效果比較，3%纖維素酶液與1%果膠酶液的組合效果明顯更好，故我們篩選出的最適混合液為:3%纖維素酶液+1%果膠酶液。

2.5 整體透明方法的比較

通過對上述試驗方法中整體透明部分的幾種不同透明方法［U3］得到的胚珠進行觀察，我們發(fā)現(xiàn)使用“乳酚甘油透明－丙酸洋紅染色”有一定的透明效果，但細胞質(zhì)與細胞核的反差小，不易觀察;“乳酸預處理－冬青油透明”比起直接透明來說，整體的脫色效果更好些，但不易進行染色處理，未染色的內(nèi)部結(jié)構(gòu)更加難以觀察;使用84消毒液透明后材料各部分輪廓清晰，分界明顯，不需要分離出胚珠即可達到很好的透明效果，但無法觀察到胚囊內(nèi)細胞及細胞核;“蘇木精染色－冬青油透明”的觀察效果最佳，同時通過反復試驗比較，先用蘇木精染色一定時間后再用低濃度醋酸分色可使觀察效果更好，而愛氏蘇木精的染色快，效率更高一些，故我們最終確立的整體染色透明技術(shù)簡述為:蘇木精明礬染液染色→醋酸分色→自來水復蘭過夜→脫水→透明→鏡檢。

上述四種透明方法的鏡檢結(jié)果分別如圖2:

圖2 微分干涉差顯微鏡下不同透明方法的鏡檢結(jié)果Fig.2 Ovules with the four clearing techniques under differential interference contrast microscope

3 討論

自整體透明技術(shù)發(fā)明以來，因其與常規(guī)的石蠟切片相比極大地節(jié)省人力和物力，所以在研究植物組織內(nèi)部結(jié)構(gòu)上具有重要的意義。近年來，陸續(xù)有對這一技術(shù)的應用和改進進行了報道。在懸鈴葉苧麻胚胎學的研究中，實驗證明我們可以直接運用整體透明技術(shù)觀察其胚胎發(fā)育，然而整體透明技術(shù)在對懸鈴葉苧麻雌花的應用中也存在不足，如透明率偏低、透明效果不穩(wěn)定、拍攝的照片清晰度不高等，主要原因在于其雌花厚厚的外包被對透明效果影響很大。若去掉外包被，直接對胚珠進行透明，透明效果大大提高。介于此，我們必須先分離出胚珠，那么就有幾種分離方法:(1)整體解剖，(2)酸處理，(3)酶解。由于懸鈴葉苧麻雌花很小，手工解剖比較困難，很容易破壞胚珠，且費時費力，不適宜采用;同時，我們在試驗中比較了酸解和酶解法對雌花的解離效果，發(fā)現(xiàn)酶解的效果要明顯好于酸解，這樣就確定了采用酶解法分離懸鈴葉苧麻胚珠。本研究通過比較不同酶的解離效果，發(fā)現(xiàn)在對懸鈴葉苧麻雌花外包被的解離上，纖維素酶起著主導作用，而果膠酶則是輔助作用;較高濃度的果膠酶液與纖維素酶液混合相反使得酶解效果變?nèi)?而低濃度的果膠酶液與纖維素酶液混合比單純用纖維素酶液的效果好，通過篩選相對最適的混合酶液，為后續(xù)的染色透明提供了大量優(yōu)質(zhì)的材料，極大地提高了透明的觀察效果。

本研究通過對幾種不同的透明方法的試驗比較，發(fā)現(xiàn)對懸鈴葉苧麻雌花而言，“蘇木精染色－冬青油透明”與其他透明技術(shù)相比，仍具有顯著的技術(shù)優(yōu)勢。在對84消毒劑這種新的透明劑進行試驗時，發(fā)現(xiàn)其在對注重整體輪廓及局部形態(tài)的觀察上有著很大的優(yōu)勢，如觀察植物胚胎發(fā)育后期的胚型;而在前期胚囊的觀察中，不清楚是否其強氧化作用對細胞核有影響，試驗中觀察不到囊內(nèi)細胞，有待進一步的了解。

［1］周嫦，楊弘遠.被子植物胚囊酶法分離的研究:固定材料的分離技術(shù)與顯微觀察［J］.植物學報，1982，24(5).

［2］楊弘遠.植物胚胎學中的整體透明技術(shù)［J］.植物學通報，1988，5(2):144—166.

［3］楊弘遠.植物有性生殖實驗研究四十年［M］.武漢:武漢大學出版社，2001.

［4］郝建華，強勝.整體透明技術(shù)在植物生物學中應用實例及其剖析［J］.植物學通報，2007，24(4):490－497.

［5］臧鞏固，趙立寧，孫敬三.赤苧無融合生殖細胞胚胎學研究［J］.植物學報，1997，39(3):210－213.

［6］趙世緒，凌祖銘，杜中.用子房整體透明法和微分干涉差顯微鏡研究水稻的胚胎發(fā)育［J］.遺傳，1993，15(4):33.

［7］杜中，趙世緒，周海鷹，王莉莉.用微分干涉差顯微鏡和子房整體透明法觀察水稻和小麥的胚囊結(jié)構(gòu)［J］.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學報，1995，3(4):94 －97.

［8］楊弘遠.用整體染色與透明技術(shù)觀察胚囊、胚、胚乳和胚狀體［J］.植物學報，1986，28(6):575－581.

［9］李彥坤.整體透明技術(shù)觀察懸鈴葉苧麻胚胎發(fā)育的方法研究［J］.中國麻業(yè)科學.2011，33(3)

［10］洪亞平.一種新整體透明技術(shù)的研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學，2010，38(8):4035－4038

［11］Liedl BE，McCormick S，Mutschler MA.A clearing technique for histochemical location of GUS activity in pollen tubes and ovules of Lycopersicon.1993，Plant Mol Biol Rep 11，194 －201.

［12］Taskin KM，Turgut K，Scott RJ.Apomictic development in Arabis gunnisoniana［J］.Isr J Plant Sci 52，2004，155－160.

［13］Herr J M Jr.A new clearing － squash technique for the study of ovule development in angiosperms［J］.Amer J Bot，1971。58:785－790.

［14］Herr J M Jr.An analysis of methods for permanently mounting ovules cleared in four－ and － a － half type clearing fluids［J］.Stain Tech，1982，57:161 －169.

［15］Palser BF，Rouse JL，Williams EG.Techniques for clearing ovules for studies of megagametophyte and early postfertilization development in Rhododendron［J］.Biotech Histochem，1992，67，207 －218.