劉 玉，王元倫，唐雨德

囊尾蚴病是我國常見的寄生蟲病，俗稱囊蟲病，其循環(huán)抗原(circulating antigen，CA)可以反映囊尾蚴在體內(nèi)的存活狀況［1］，可以用于囊尾蚴病的診斷與療效考核［2，3］。IgY是特定抗原免疫產(chǎn)蛋母雞后在雞卵黃中形成的多克隆抗體，即卵黃抗體(immunoglobulin Y)。本文應用抗囊尾蚴CA的IgY和酶標記抗CA單克隆抗體1A5組合，建立一種新型雙抗體夾心ELISA檢測囊尾蚴CA，以探討IgY用于囊尾蚴病免疫診斷的可行性，現(xiàn)將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 血清與抗體 經(jīng)CT和藥物治療結合確診的囊尾蚴病患者樣品158份(其中血清139份，腦囊尾蚴病患者腦脊液19份)，分別獲自內(nèi)蒙古通遼囊蟲病醫(yī)院、南京腦科醫(yī)院、南京軍區(qū)總醫(yī)院和南京454醫(yī)院;經(jīng)剖檢確診的囊尾蚴病病豬血清222份，采自內(nèi)蒙古興安盟科右前旗;健康人血清50份，采自南京的健康體檢人員;健康豬血清20份，采自江蘇鎮(zhèn)江某部隊農(nóng)場;3份弓形蟲病患者血清由濟南軍區(qū)軍事醫(yī)學研究所提供，8份包蟲病患者血清由新疆軍區(qū)防疫隊提供?？鼓椅豺蔆A單克隆抗體1A5由本課題組制備并保存［4］。

1.2 囊尾蚴 CA 由課題組采用親和層析法純化［3］，-20℃保存;弓形蟲與棘球蚴純化抗原分別由濟南軍區(qū)軍事醫(yī)學研究所與新疆軍區(qū)防疫隊贈與。

1.3 抗囊尾蚴CA-IgY的制備與鑒定 取500 μg CA與等體積福氏完全佐劑乳化經(jīng)翅下靜脈注射25周齡來亨蛋雞10只(首次劑量為500 μg/只，加強劑量為200 μg/只)，每次間隔10 d。首次免疫7 d后開始收集雞蛋。用水稀釋法提取IgY［5-6］，－20℃保存?zhèn)溆?。采用紫外吸收法測定純化后IgY的濃度，并采用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析其相對分子量和純度，間接ELISA檢測IgY的活性與特異性。

1.4 血清處理方法 采用IC沸浴法［4］。

1.5 抗囊尾蚴CA單克隆抗體1A5的酶標記 采用簡易過碘酸鈉法［4］標記辣根過氧化物酶(HRP)，HRP為Sigma公司產(chǎn)品。

1.6 IgY-ELISA的方法建立 將IgY按常規(guī)包被ELISA反應孔中，洗板后，用100 g/L的脫脂奶粉液(或牛血清清蛋白)37℃封閉2 h，PBS-T液洗滌3次;加入已處理的待測標本100 μl，37℃溫育30～60 min后，PBS-T液洗滌3次;加入稀釋好的HRP-1A5100 μl，37 ℃ 溫育 30 ～60 min，PBS-T 液洗滌 5次，采用TMB顯色方法，測定吸光值(A450)。每板均設陽性對照和陰性對照，以A值＞陰性對照的2.1倍作為陽性判定標準。通過正交試驗來確定最佳檢測條件，設立4個實驗因素，每因素設2個水平，分別為IgY包被濃度、血清溫育時間、酶標抗體濃度和加酶標抗體后溫育時間。

1.7 方法的敏感性與特異性 用已建立的方法檢測囊尾蚴病患者血清、腦脊液、病豬血清以及健康人與健康豬血清以及3份弓形蟲病患者血清、8份包蟲病患者血清并與雙單抗-ELISA［4，7］比較，驗證方法的敏感性、特異性與可行性。

2 結果

2.1 抗囊尾蚴CA-IgY的鑒定 首次免疫后10 d卵黃內(nèi)檢測到有特異性抗囊尾蚴CA-IgY，加強免疫后效價逐步上升，至30 d，瓊脂擴散效價達1∶128，并維持到55 d。每枚蛋黃經(jīng)提純后可得到約66.12 mg IgY，經(jīng)SDS-PAGE分析，純化后的IgY在約65 ku處和25 ku處可見2條清晰的條帶，分別為IgY的重鏈和輕鏈(圖1)。間接ELISA顯示IgY與囊尾蚴CA發(fā)生特異反應，ELISA效價大于108，與棘球蚴抗原、弓形蟲抗原反應的ELISA效價小于10。

圖1 lgY純化前后SDS-PAGE分析1:低分子量蛋白標志物;2:純化前IgY;3:純化后lgY

2.2 雙抗體夾心ELISA方法的建立 經(jīng)正交試驗最終確定的檢測條件為:IgY包被濃度1∶1000、被檢血清溫育時間為60 min;酶標記單抗?jié)舛葹?∶800，溫育時間為30 min。

2.3 靈敏度 IgY-ELISA和雙單抗-ELISA檢測囊尾蚴 CA 的靈敏度分別為8.3 μg/L 和13.9 μg/L。

2.4 方法的敏感性與特異性 應用IgY-ELISA和雙單抗-ELISA對450份樣品檢測結果比較，差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05，表1)。

表1 基于IgY和雙單抗的夾心ELISA檢測結果比較

3 討論

囊尾蚴CA的檢測可作為療效考核指標［2-3］。建立高敏感性和特異性的CA檢測方法是當前囊尾蚴病防治中亟待解決的問題之一?，F(xiàn)有的囊尾蚴CA檢測方法敏感性與特異性還有待提高，其原因可能是因為CA多為囊尾蚴的代謝分泌物，易受到機體免疫系統(tǒng)的清除，從而導致CA在患者血清中含量不高，獨特型抗體的存在也能影響到循環(huán)抗原的檢測［8-9］。此外，囊尾蚴CA與棘球蚴抗原存在嚴重的交叉反應［9-10］。應用單克隆抗體作為檢測系統(tǒng)，解決了特異性問題，但敏感性降低，而使用多克隆抗體作為檢測系統(tǒng)，其特異性較差［11］。

本實驗利用IgY的優(yōu)點［5］，制備出抗囊尾蚴CA的高效價IgY抗體，SDS-PAGE與間接ELISA結果顯示，純化效果較好，可與CA發(fā)生特異反應，而與棘球蚴和弓形蟲抗原不發(fā)生交叉反應。利用純化的抗囊尾蚴CA-IgY作為捕獲抗體、酶標記單抗1A5為檢測抗體，建立了檢測囊尾蚴CA的夾心ELISA法。其靈敏度為8.3 μg/L，高于雙單抗-ELISA 的13.9 μg/L。從表1可知，IgY-ELISA對139例囊尾蚴患者血清、19例腦囊尾蚴患者腦脊液和222份囊尾蚴病豬血清進行檢測，CA陽性率分別為100.0%、89.5%和100.0%，而雙單抗-ELISA的陽性率分別為97.8%、84.2% 和 100.0%;對 50 份非疫區(qū)正常人與20份健康豬的血清檢測，CA陰性率均為100%，而雙單抗-ELISA則分別為98%和100.0%。兩種方法對弓形蟲病患者和包蟲病患者血清檢測，結果均為陰性。經(jīng)統(tǒng)計學分析，IgY-ELISA與雙單抗-ELISA的敏感性與特異性沒有顯著性差異，但前者的靈敏度似高于后者。

從理論上分析，本文所建立的檢測方法采用多抗與單抗夾心的檢測模式，多抗針對抗原的位點多［12］，用作捕捉抗體可以提高檢測的敏感性;而單抗針對抗原的位點單一，用作檢測抗體則可以提高檢測的特異性［13］。由于雞與哺乳動物種系發(fā)生學關系較遠，且IgY制備及純化技術簡單、成熟，卵黃中提取的IgY純度高、含量大，將IgY應用于免疫診斷中，可減少假陽性的出現(xiàn)［14］，從而提高檢測的敏感性與特異性。

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