劉曉影，陳麗梅，張寶剛，馮衛(wèi)國(guó)，王守訓(xùn)，杜長(zhǎng)青，劉順梅，趙春玲

PLK1(polo-like kinase 1)是一種高度保守的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的絲氨酸/蘇氨酸激酶。PLK1在細(xì)胞有絲分裂的不同時(shí)期都起到十分重要的作用［1－3］。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，在大多數(shù)人類(lèi)腫瘤中PLK1均表現(xiàn)為高表達(dá)，而且PLK1的過(guò)高表達(dá)在結(jié)直腸癌、直腸癌、非肌肉浸潤(rùn)性膀胱癌患者均提示預(yù)后不良［4－7］，提示 PLK1 有可能成為惡性腫瘤治療的新靶點(diǎn)。已有研究表明PLK1與食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展有一定的關(guān)系［8－9］，我們前期研究表明 PLK1 在鱗狀食管癌組織中呈高表達(dá)，且PLK1的表達(dá)程度與食管鱗癌的分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［10］，但PLK1影響腫瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制尚不明確。本研究利用RNA干擾技術(shù)降低食管鱗癌細(xì)胞中PLK1基因的表達(dá)，探討PLK1的RNA干擾對(duì)食管鱗癌細(xì)胞惡性生長(zhǎng)的影響及其相關(guān)機(jī)制，為進(jìn)一步研究PLK1在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展中的作用及以PLK1為靶點(diǎn)的食管鱗癌基因治療的可行性奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 RPMI 1640培養(yǎng)基、胰酶和 FBS購(gòu)自Gibco公司;食管鱗癌細(xì)胞TE-8購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù);LV-NC和LV-PLK1重組慢病毒為本實(shí)驗(yàn)室制備(重組慢病毒載體的構(gòu)建及具體序列已發(fā)表 );RNAiso Plus、PrimeScript?RT reagent Kit、SYBR?PrimeScript?RT-PCR Kit均購(gòu)自 TaKaRa公司。RIPA細(xì)胞裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒均購(gòu)自Beyotime公司。兔抗人PLK1單抗、兔抗人β-actin單抗和HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗、鼠抗人CD31和Caspase-3抗體、生物素化二抗、HRP標(biāo)記的三抗均購(gòu)自Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 食管鱗癌細(xì)胞TE-8的培養(yǎng)及慢病毒感染RPMI 1640培養(yǎng)基(含10%FBS)培養(yǎng)食管鱗癌細(xì)胞TE-8(簡(jiǎn)稱(chēng)TE-8)。在細(xì)胞培養(yǎng)瓶(75 cm2)中，接種1×106個(gè)食管鱗癌細(xì)胞，加入病毒上清稀釋液(10 MOI)混勻后放入CO2培養(yǎng)箱(37℃，5%CO2)，24 h后移去病毒上清稀釋液，加入RPMI 1640培養(yǎng)基(10%FBS)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 熒光定量 PCR檢測(cè)食管鱗癌細(xì)胞株中PLK1基因在mRNA水平的表達(dá) 利用RNAiso Plus和PrimeScript?RT reagent Kit從體外培養(yǎng)的食管鱗癌細(xì)胞株中提取總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。利用SYBR?PrimeScript?RT-PCR Kit進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，具體步驟參考試劑盒說(shuō)明書(shū)。反應(yīng)條件為:94℃ 2 min;94℃ 30 s，60℃ 15 s，72℃ 15 s，30 個(gè)循環(huán);72℃ 10 min。本研究所用引物由賽百勝公司合成。PLK1上游引物:5'-TGACGAGTTCTTTACTTCTGGC-3'，下游引物:5'-CAGGCTGTCACCATCATTGTAG-3'，退火溫度是60℃，擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度是451 bp;內(nèi)參 β-actin上游引物:5'-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3'，下 游 引 物:5'-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3'，退火溫度是55℃，擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度是206 bp。

1.2.3 Western blot檢測(cè)食管鱗癌細(xì)胞株中 PLK1基因在蛋白質(zhì)水平的表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的食管鱗癌細(xì)胞株，利用RIPA細(xì)胞裂解液試劑盒進(jìn)行蛋白質(zhì)樣品制備，并參照BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定量。每孔上樣30 μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳后利用半干法轉(zhuǎn)膜，將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到 PVDF膜上，封閉后分別加入一抗(兔抗人PLK1單抗1∶1 000稀釋;兔抗人 actin單抗1∶2 000稀釋)和 HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶2 000稀釋)，洗滌后，與 ECL試劑反應(yīng)處理曝光，對(duì)蛋白質(zhì)條帶進(jìn)行分析。

1.2.4 裸鼠皮下移植瘤模型實(shí)驗(yàn)檢測(cè)食管鱗癌細(xì)胞的體內(nèi)惡性生長(zhǎng)能力 選取5～8周的裸鼠10只，分成2組。消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的TE-8，再用無(wú)血清無(wú)抗生素的培養(yǎng)液洗細(xì)胞2次，并配成1×107個(gè)細(xì)胞/100 μl的細(xì)胞懸液。將制備好的細(xì)胞懸液接種于裸鼠皮下(接種量約為100 μl/只)。常規(guī)飼養(yǎng)裸鼠，皮下移植瘤的體積達(dá)到6 mm×6 mm時(shí)開(kāi)始通過(guò)皮下注射的方式進(jìn)行分組治療。實(shí)驗(yàn)治療組每次每只裸鼠注射2×106TU的LV-PLK1重組慢病毒;對(duì)照組注射與實(shí)驗(yàn)治療組相同劑量的LV-NC重組慢病毒。每3 d治療1次，共治療10次。治療完畢將裸鼠處死，取出瘤體，觀(guān)察測(cè)量瘤體的體積，分組統(tǒng)計(jì)，拍照。

1.2.5 裸鼠皮下移植瘤組織Caspase-3和CD31免疫組化的檢測(cè) 采用免疫組化SABC法對(duì)Caspase-3和CD31進(jìn)行免疫組化檢測(cè)。主要步驟為:處死裸鼠后，取出腫瘤，標(biāo)本用4%多聚甲醛固定，常規(guī)脫水透明、浸蠟、石蠟包埋，切成厚4 μm的連續(xù)切片，經(jīng)常規(guī)脫蠟至水，50 ml·L－1H2O2去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，抗原修復(fù)后50 ml·L－1羊血清封閉非特異結(jié)合蛋白，滴加1∶50稀釋的一抗(鼠抗人Caspase-3，鼠抗人 CD31)，4℃孵育過(guò)夜;生物素化二抗、HRP標(biāo)記的三抗室溫孵育各1 h，加DAB顯色，經(jīng)蘇木素復(fù)染、脫水透明，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀(guān)察結(jié)果并拍照。以細(xì)胞深染成顆粒狀棕黃色為陽(yáng)性表達(dá)。

1.2.6 新生血管密度(MVD)的計(jì)算 CD31免疫組化染色陽(yáng)性顯示為新生微血管密度，其判定方法:CD31染色的組織標(biāo)本中觀(guān)察到由內(nèi)皮細(xì)胞或幼稚內(nèi)皮細(xì)胞形成的管狀、窄隙狀、囊狀和空泡狀染成黃褐色的結(jié)構(gòu)即判定為可計(jì)數(shù)的微血管。400倍光鏡下計(jì)數(shù)全部橫切和縱切的微血管數(shù)作為MVD計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 慢病毒介導(dǎo)的PLK1基因沉默 RNA干擾能明顯抑制食管鱗癌細(xì)胞中PLK1的表達(dá)。介導(dǎo)PLK1基因RNA干擾的重組慢病毒(LV-PLK1)和對(duì)PLK1基因表達(dá)無(wú)影響的對(duì)照組慢病毒(LV-NC)分別感染食管鱗癌細(xì)胞，72 h后利用熒光定量PCR和Western blot分別在mRNA水平和蛋白質(zhì)水平上檢測(cè)PLK1的表達(dá)量。結(jié)果如Fig 1所示，LV-PLK1在mRNA水平上產(chǎn)生明顯的干擾效應(yīng)，與LV-NC組相比，其干擾效率約為73%(Fig 1B)。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，在蛋白質(zhì)水平上PLK1的表達(dá)同樣低于陰性對(duì)照組，β-actin作為內(nèi)參(Fig 1A)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，重組慢病毒(LV-PLK1)能明顯抑制食管鱗癌細(xì)胞中PLK1的表達(dá)。

Fig 1 Detection of PLK1 interference efficiency

2.2 靶向干擾PLK1基因表達(dá)的慢病毒抑制食管鱗癌體內(nèi)的生長(zhǎng) 給予種植移植瘤的裸鼠注射LVPLK1進(jìn)行治療，結(jié)果顯示，LV-PLK1治療組的移植瘤瘤體大小明顯比對(duì)照組(注射同劑量LV-NC)小。測(cè)量瘤體體積并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，LV-PLK1治療組與對(duì)照組的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，結(jié)果如Fig 2所示。該結(jié)果表明，靶向PLK1的基因沉默能明顯抑制裸鼠體內(nèi)移植瘤的生長(zhǎng)。

Fig 2 Effects of lentiviral vector mediated RNAinterference targeting human PLK1 gene on transplantedesophageal squamous cell carcinoma in nude mice

2.3 靶向干擾PLK1基因表達(dá)的慢病毒誘導(dǎo)體內(nèi)食管鱗癌細(xì)胞的凋亡 Caspase家族在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過(guò)程中起著非常重要的作用，其中Caspase-3為關(guān)鍵的執(zhí)行分子，它在凋亡信號(hào)傳導(dǎo)的許多途徑中發(fā)揮功能，活化的Caspase-3能夠?qū)е录?xì)胞凋亡。在裸鼠皮下移植瘤中，Caspase-3免疫組化染色結(jié)果顯示:Caspase-3陽(yáng)性染色位于胞質(zhì)中，被深染成顆粒狀棕黃色，LV-PLK1治療組的裸鼠皮下移植瘤中Caspase-3染色強(qiáng)度明顯高于對(duì)照組(LV-NC)，結(jié)果如Fig 3所示。因此，PLK1基因被RNA干擾后誘導(dǎo)的食管鱗癌細(xì)胞的凋亡在移植瘤的生長(zhǎng)抑制中也起重要作用。

Fig 3 Expression of Caspase-3 in the transplanted tumor tissue of esophageal squamous cell carcinoma in nude mice

2.4 靶向干擾PLK1基因表達(dá)的慢病毒能抑制食管鱗癌微血管生成 CD31可以標(biāo)染血管內(nèi)皮細(xì)胞，染色位于內(nèi)皮細(xì)胞表面。在免疫組化中，CD31主要用于證明內(nèi)皮細(xì)胞組織的存在，用于評(píng)估腫瘤血管生成。對(duì)裸鼠皮下移植瘤進(jìn)行CD31免疫組化染色，如Fig 4所示，可以觀(guān)察到不規(guī)則的微血管網(wǎng)(呈棕黃色)。LV-PLK1治療組MVD數(shù)目比對(duì)照組(LV-NC)明顯減少(P＜0.01)，如Tab 1所示。這表明PLK1在食管鱗癌的微血管生成調(diào)控中起重要作用。裸鼠體內(nèi)移植瘤的生長(zhǎng)抑制除了與PLK1基因被RNA干擾后能直接抑制細(xì)胞增殖有關(guān)外，食管鱗癌的血管生成抑制也起了重要作用。

Fig 4 Expression of CD31 in the transplanted tumor tissue of esophageal squamous cell carcinoma in nude mice

Tab 1 Statistical results of new microvessel density(MVD)in subcutaneous transplanted tumor in nude mice±s，n=5)

Tab 1 Statistical results of new microvessel density(MVD)in subcutaneous transplanted tumor in nude mice±s，n=5)

＊＊P＜0.01 vs LV-NC

Group MVD LV-NC 112.67 ±4.3 LV-PLK1 24.78 ±3.1＊＊

3 討論

作為調(diào)控細(xì)胞周期正常進(jìn)行、中心體成熟的重要的絲氨酸/蘇氨酸激酶，PLK1于1994年由瑞士實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤研究所的Golsteyn等［11］最先報(bào)道。近年來(lái)的研究表明，在大多數(shù)人類(lèi)腫瘤中PLK1均表現(xiàn)為高表達(dá)［4－7］，PLK1能否成為腫瘤治療的靶點(diǎn)也成為新的研究熱點(diǎn)。RNA干擾技術(shù)［12］的出現(xiàn)為我們提供了新的基因功能研究與基因治療手段。研究發(fā)現(xiàn):在原位膀胱癌模型中應(yīng)用雙靶向 survivin和PLK1的RNA干擾進(jìn)行膀胱內(nèi)滴注，能明顯減少瘤體體積［13］。Xu 等［14］的研究表明，靶向 PLK1 的RNA干擾能明顯抑制結(jié)直腸癌的體內(nèi)外生長(zhǎng)。Sp?nkuch-Schmitt等［15］在 2002 年 就 發(fā) 現(xiàn)，靶 向PLK1的RNA干擾能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。

為了研究PLK1在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展中的作用及PLK1能否作為食管鱗癌潛在的治療靶點(diǎn)，我們前期研究結(jié)果表明，通過(guò)PLK1 siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，靶向PLK1的RNA干擾能明顯抑制食管鱗癌細(xì)胞的體外惡性增殖。盡管所用食管鱗癌細(xì)胞系不同，我們的結(jié)果與Bu等［8］的體外研究結(jié)果一致。為了進(jìn)一步客觀(guān)地在動(dòng)物整體水平評(píng)價(jià)PLK1對(duì)食管鱗癌發(fā)生發(fā)展的作用及作為治療靶點(diǎn)的可行性，我們又通過(guò)建立的裸鼠皮下移植瘤模型，應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的靶向PLK1的RNA干擾的重組慢病毒載體進(jìn)行皮下注射治療，結(jié)果表明靶向沉默PLK1基因的表達(dá)能明顯抑制裸鼠體內(nèi)移植瘤的生長(zhǎng)。

Caspase-3免疫組化染色顯示體內(nèi)移植瘤細(xì)胞凋亡的結(jié)果表明:靶向PLK1的RNA干擾裸鼠體內(nèi)移植瘤的生長(zhǎng)抑制，除了與PLK1基因被RNA干擾后能直接抑制細(xì)胞增殖有關(guān)外，PLK1的低表達(dá)通過(guò)誘導(dǎo)Caspase-3的表達(dá)，從而引起食管鱗癌細(xì)胞的凋亡在移植瘤的生長(zhǎng)抑制中也起了重要作用。PLK1如何影響食管鱗癌細(xì)胞中Caspase-3的表達(dá)，目前尚未見(jiàn)研究報(bào)道，需要做深入的研究。

通過(guò)CD31免疫組化染色顯示新生血管密度，發(fā)現(xiàn)靶向PLK1的RNA干擾抑制了食管鱗癌的血管生成，這表明PLK1在食管鱗癌的血管生成調(diào)控中起到一定的作用。目前，已有研究表明血管生成是包括食管癌在內(nèi)的實(shí)體腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的必要因素［16］，但PLK1與腫瘤血管生成的關(guān)系目前尚無(wú)研究報(bào)道。影響腫瘤血管生成最關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因素為:血管生成因子與抑制因子的平衡狀態(tài)。失平衡將促使腫瘤從無(wú)血管期轉(zhuǎn)化為血管期，新生血管形成，腫瘤體積迅速增大，這一過(guò)程被稱(chēng)為“血管生成開(kāi)關(guān)機(jī)制(angiogenic switch)”［17］，食管鱗癌的血管生成也是如此［18－19］。PLK1可能通過(guò)調(diào)控血管生成因子或抑制因子的表達(dá)，促進(jìn)食管鱗癌血管的生成，從而推動(dòng)了其惡性發(fā)展，這將是我們今后研究的一個(gè)主要方向。

總之，靶向人PLK1的RNA干擾能有效抑制食管鱗癌細(xì)胞體內(nèi)外的生長(zhǎng)，下調(diào)的PLK1可能通過(guò)調(diào)控Caspase-3的表達(dá)而誘導(dǎo)食管鱗癌細(xì)胞凋亡，通過(guò)抑制食管鱗癌的血管生成而抑制了食管鱗癌的惡性進(jìn)展。PLK1有可能是治療食管鱗癌的一個(gè)新靶點(diǎn)。

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