劉 芳，李傳禮，何永盛，張毅杰，楊 平

（深圳市計量質(zhì)量檢測研究院，廣東深圳518131）

抗生素殘留是乳品行業(yè)面臨的一個重要安全問題[1-3]。以青霉素為代表的β-內(nèi)酰胺類抗生素可用于治療牛乳房炎和其他細(xì)菌感染性疾病[4]，然而過度使用或濫用會導(dǎo)致其通過乳牛機體的血液殘留于牛奶中。我國對生鮮乳中抗生素的含量作出了嚴(yán)格規(guī)定[5]，然而部分不法商販和奶農(nóng)把β-內(nèi)酰胺酶加入到牛奶中，掩蓋其抗生素殘留超標(biāo)的事實，這可能會使消費者對青霉素等抗生素類藥物耐藥性增高[6]。為了保障人民群眾身體健康，有必要建立快速有效的方法來檢測乳制品中的β-內(nèi)酰胺酶。研究者已建立了多種方法檢測乳制品中的β-內(nèi)酰胺酶[7-10]，但這些方法均存在著一定的不足。碘量法的靈敏度和重現(xiàn)性較差；酸測定法存在假陽性和假陰性的問題；液相色譜法的樣品前處理步驟繁瑣，檢測儀器昂貴；微生物法的檢測周期較長。與之相比，利用試劑盒建立的快速檢測方法不需要經(jīng)過復(fù)雜的樣品前處理，操作簡便，結(jié)果精確而且直觀易懂[11]，因此也越來越多地被應(yīng)用到β-內(nèi)酰胺酶的檢測當(dāng)中。目前對β-內(nèi)酰胺酶檢測的研究多集中在以一種或兩種檢測方法對某一類乳制品中的β-內(nèi)酰胺酶進行檢測，為β-內(nèi)酰胺酶在不同種類乳制品中建立相應(yīng)的檢測方法并分別確定其最低檢出限的報道尚不多見。Charm試劑盒法作為一種免疫分析方法，利用β-內(nèi)酰胺酶可分解β-內(nèi)酰胺類抗生素的原理，通過配體-受體識別法快速檢測與β-內(nèi)酰胺酶反應(yīng)后殘留的青霉素的含量，從而可以間接檢測樣品中是否含有β-內(nèi)酰胺酶。本研究嘗試?yán)肅harm試劑盒建立一種快速檢測方法，測定β-內(nèi)酰胺酶在不同種類乳制品中的最低檢出限，并以杯碟法作為比較，利用這兩種方法進行樣品的檢測，為建立不同種類乳制品中β-內(nèi)酰胺酶的檢測方法提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藤黃微球菌（Micrococcus luteus） CMCC（B）28001，購自中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心；β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)品（0.54U/mg）、青霉素G標(biāo)準(zhǔn)品 sigma公司；舒巴坦 Fluorochem公司；抗生素鑒定培養(yǎng)基Ⅱ 北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；牛津杯 深圳新拓?fù)渖锟萍加邢薰?；Charm試劑盒、孵育器和讀數(shù)儀 北京博歐實德生物技術(shù)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品的前處理 液態(tài)奶樣品可直接使用；酸奶樣品用磷酸鹽緩沖液（p H7.4）按1∶4（v/v）的比例進行稀釋；奶粉和奶酪樣品用磷酸鹽緩沖液（pH7.4）按1∶7（m/v）的比例進行稀釋。

1.2.2 快速檢測法測定乳制品中β-內(nèi)酰胺酶最低檢出限 準(zhǔn)確稱取一定量的β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)品，以前處理后的乳制品為溶劑，配制成濃度為1.0×10-4～1.0×10-3U/mL的加標(biāo)樣液，從不同濃度的加標(biāo)樣液中取出300μL至1.5mL離心管，加入60μL青霉素陽性質(zhì)控液，配成待檢溶液，室溫下反應(yīng)3min。用移液槍取出300μL待檢溶液，滴加至檢測條的凹槽中，56℃孵育8min，取出后3min內(nèi)判讀結(jié)果。根據(jù)加標(biāo)樣液的檢測結(jié)果確定每個樣品在快速檢測法中的β-內(nèi)酰胺酶檢出限，以每類乳制品中檢出限的最大值作為該類乳制品在快速檢測法中的β-內(nèi)酰胺酶最低檢出限。

1.2.3 杯碟法測定乳制品中β-內(nèi)酰胺酶最低檢出限

準(zhǔn)確稱取一定量的β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)品，配制濃度為1.5×10-3U/mL的β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)溶液，同時以前處理后的乳制品為溶劑，配制濃度為1.0×10-5～5.0×10-5U/mL的加標(biāo)樣液，參照《乳及乳制品中舒巴坦敏感β-內(nèi)酰胺酶類藥物檢驗方法——杯碟法》進行檢測和結(jié)果判定。根據(jù)加標(biāo)樣液的檢測結(jié)果確定每個樣品在杯碟法中的β-內(nèi)酰胺酶檢出限，以每類乳制品中檢出限的最大值作為該類乳制品在杯碟法中的β-內(nèi)酰胺酶最低檢出限。

1.2.4 樣品中β-內(nèi)酰胺酶的檢測 從市場上購買不同品牌的液態(tài)奶、酸奶、奶粉、奶酪等乳制品以及原料奶作為樣品，分別用快速檢測法和杯碟法進行檢測，以此比較兩種方法的β-內(nèi)酰胺酶檢出率。

1.2.5 β-內(nèi)酰胺酶的耐熱性和耐久性實驗 以液態(tài)奶為溶劑配制濃度范圍為8.0×10-5～5.0×10-4U/mL的β-內(nèi)酰胺酶加標(biāo)樣液，于室溫下放置一周，期間每天均用快速檢測法對不同濃度加標(biāo)樣液中β-內(nèi)酰胺酶的殘留活性進行檢測。另外，配制濃度范圍為8.0×10-5～8.0×10-4U/mL的β-內(nèi)酰胺酶加標(biāo)樣液，模擬巴氏殺菌（65℃ 30min或75℃ 15s）以及保持滅菌（115℃10min）的條件，對加標(biāo)樣液進行加熱處理，用快速檢測法檢測β-內(nèi)酰胺酶的殘留活性，研究這些處理方式對β-內(nèi)酰胺酶活性的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 快速檢測法中β-內(nèi)酰胺酶最低檢出限的測定

選取液態(tài)奶、酸奶、奶粉和奶酪各10種產(chǎn)品進行快速檢測法的加標(biāo)實驗。加標(biāo)乳制品中β-內(nèi)酰胺酶的濃度控制在1.0×10-4～1.0×10-3U/mL之間，以每類乳制品中β-內(nèi)酰胺酶檢出限的最大值作為該類乳制品在快速檢測法中的最低檢出限。表1的檢測結(jié)果顯示，液態(tài)奶中β-內(nèi)酰胺酶的檢出限最低，而其他乳制品由于在前處理中以磷酸鹽緩沖液按一定的比例進行了稀釋，所以折算后的β-內(nèi)酰胺酶檢出限均比液態(tài)奶高。

表1 不同乳制品在快速檢測法中的β-內(nèi)酰胺酶最低檢出限Table 1 Detection limit ofβ-lactamase in different dairy product base on Charm detection method

2.2 杯碟法中β-內(nèi)酰胺酶最低檢出限的測定

同樣選取液態(tài)奶、酸奶、奶粉和奶酪各10種樣品進行杯碟法的加標(biāo)實驗。加標(biāo)乳制品中β-內(nèi)酰胺酶的濃度控制在1.0×10-5～5.0×10-5U/mL之間，實驗的結(jié)果如表2所示。與快速檢測法得出的結(jié)果類似，液態(tài)奶樣品中β-內(nèi)酰胺酶的檢出限低于其他三類乳制品，而在杯碟法中每類乳制品測得的β-內(nèi)酰胺酶最低檢出限都要低于快速檢測法中對應(yīng)的測定值。

表2 不同乳制品在杯碟法中的β-內(nèi)酰胺酶最低檢出限Table 2 Detection limit ofβ-lactamase in different dairy product based on cylinder plate method

2.3 兩種方法對樣品的檢測

從市場上購買不同品牌的液態(tài)奶、酸奶、奶粉、奶酪樣品以及數(shù)批原料奶，運用快速檢測法和杯碟法分別對這些樣品進行檢測。表3的檢測結(jié)果顯示，液態(tài)奶、酸奶、奶粉和奶酪樣品均未檢出β-內(nèi)酰胺酶，而50個原料奶樣品中有一個檢出β-內(nèi)酰胺酶呈陽性，兩種檢測方法得出的結(jié)果完全一致，說明兩種方法均能滿足實際樣品檢測的需要。

2.4 β-內(nèi)酰胺酶的耐久性實驗

用液態(tài)奶配制濃度范圍為8.0×10-5～5.0×10-4U/mL的β-內(nèi)酰胺酶加標(biāo)樣液，于室溫下放置一周，期間每隔24h用快速檢測法對不同濃度加標(biāo)樣液中β-內(nèi)酰胺酶的殘留活性進行檢測。從表4的檢測結(jié)果可以看出，加標(biāo)樣液放置2d后其β-內(nèi)酰胺酶活性有所下降，最低檢出限由1.0×10-4U/mL提高至2.0×10-4U/mL，但隨后放置至第7d為止，其最低檢出限仍與放置2d后的檢測結(jié)果相同，而有研究報道[12]也顯示β-內(nèi)酰胺酶放置4d后仍具有很強的抗生素降解能力，這表明存放時間對β-內(nèi)酰胺酶活性的影響并不大。

表3 快速檢測法和杯碟法對樣品的檢測結(jié)果Table 3 Detection results of dairy products by Charm detection method and cylinder plate method

表4 放置時間對β-內(nèi)酰胺酶活性的影響Table 4 Influence of storage time to the enzymatic activity ofβ-lactamase

2.5 β-內(nèi)酰胺酶的耐熱性實驗

用液態(tài)奶配制濃度范圍為8.0×10-5～8.0×10-4U/mL的β-內(nèi)酰胺酶加標(biāo)樣液，模擬巴氏殺菌和保持滅菌的條件對加標(biāo)樣液進行加熱處理，研究這些處理對β-內(nèi)酰胺酶活性的影響，試驗的結(jié)果如表5所示。75℃加熱處理15s的巴氏殺菌方式并沒有對加標(biāo)樣液中β-內(nèi)酰胺酶的活性造成影響，而另外一種巴氏殺菌方式（65℃ 30min）則使β-內(nèi)酰胺酶的活性有所降低，導(dǎo)致加標(biāo)樣液中β-內(nèi)酰胺酶的最低檢出限由原來的1.0×10-4U/mL提高至4.0×10-4U/mL，這與Korycka等[13]的研究結(jié)果相吻合。保持滅菌（115℃，10min）的處理方式對β-內(nèi)酰胺酶的活性影響最大，經(jīng)過這種處理后，即使加標(biāo)樣液中β-內(nèi)酰胺酶的濃度高達8.0×10-4U/mL時也不能被檢測出含有β-內(nèi)酰胺酶。

表5 加熱處理對β-內(nèi)酰胺酶活性的影響Table 5 Influence of heating treatment to the enzymatic activity ofβ-lactamase

3 結(jié)論

3.1 本研究利用快速檢測法和杯碟法分別測定了不同乳制品中β-內(nèi)酰胺酶的最低檢出限。不同乳制品中β-內(nèi)酰胺酶在快速檢測法中的檢出限為1.5×10-4～1.6×10-3U/mL（U/g），在杯碟法中則為2.0×10-5～1.6×10-4U/mL（U/g），兩種方法對β-內(nèi)酰胺酶的最低檢出限均能滿足樣品檢測的需要，兩者在樣品檢測中的β-內(nèi)酰胺酶檢出率也相同。

3.2 快速檢測法操作簡單，節(jié)省時間，無需大型設(shè)備儀器，對β-內(nèi)酰胺酶檢測的靈敏度和準(zhǔn)確性均與杯碟法相當(dāng)，因此很適合在基層單位中作為檢測β-內(nèi)酰胺酶的主要手段。杯碟法對β-內(nèi)酰胺酶的檢出限雖然比快速檢測法稍低，但其耗時長，操作復(fù)雜，對試驗的要求嚴(yán)格，較難滿足快速檢測乳制品中β-內(nèi)酰胺酶的需要，可以作為快速檢測法檢測結(jié)果的確證方法。

3.3 β-內(nèi)酰胺酶的耐久性和耐熱性實驗表明，乳制品的存放時間對β-內(nèi)酰胺酶的活性影響不大，但加熱殺菌工藝則較為明顯地降低了β-內(nèi)酰胺酶的活性，可能會降低β-內(nèi)酰胺酶在乳制品中的檢出率。由此可見，為了杜絕β-內(nèi)酰胺酶在乳制品中的非法添加使用，應(yīng)從原料奶的質(zhì)量安全進行監(jiān)控，從而保障人民群眾喝上放心奶。

[1]何金環(huán)，王一凡.TTC和ELISA法檢測純牛奶中抗菌藥物殘留比較[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35（9）：2576-2577.

[2]買合木提·克衣木，宋迎春，買熱木尼沙·吾甫爾.無公害牛奶安全生產(chǎn)探析[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2009（3）：239-240.

[3]梁勇，李巧蘇.關(guān)于動物源食品安全性的思考[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2008（17）：295-296.

[4]陸松才.奶牛乳房炎病因分析和防治[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2007（8）：103-111.

[5]NY5045-2008.無公害食品生鮮牛乳[S].北京：中華人民共和國農(nóng)業(yè)部.

[6]魏國美.杯碟法測定乳與乳制品中β-內(nèi)酰胺酶[J].福建分析測試，2010，19（3）：57-59.

[7]Sykes R B，Nordstrom K.Microiodometric Determination of β-Lactamase Activity[J].American Society for Microbiology，1972（2）：94-99.

[8]馬潔，李孝君.利用酸度計檢測奶制品中殘留的β-內(nèi)酰胺酶[J].化學(xué)通報，2009 （4）：370-373.

[9]趙靜枚，都絳瑛，張銘俊.青霉素裂解液的高效液相色譜分析[J].色譜，2001，19 （1）：88-89.

[10]Cui S， Li J， Hu C， et al.Development of a method for the detection ofβ-lactamases in milk sample[J].Journal of AOAC International，2007，90（4）：1128-1132.

[11]康海英，王加啟，卜登攀，等.兩種檢測生鮮乳中β-內(nèi)酰胺酶方法的比較[J].生物技術(shù)通報，2010（6）：202-205.

[12]劉志楠，喻東威，趙源，等.乳與乳制品中β-內(nèi)酰胺酶的特性及檢測方法[J].中國乳品工業(yè)，2011，39（1）：53-55.

[13]Korycka-Dahl M，Richardson T，Bradley R L Jr.Use of microbial beta-lactamase to destroy penicillin added to milk[J].Journal of Dairy Science，1985，68（8）：1910-1916.