羅曉琴，方華林，張德紅，孫 震，趙正苗，崔廷婷

（1.北京勤邦生物技術(shù)有限公司，北京 102206；2.遵義縣茍江鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)服務(wù)中心，貴州遵義563101）

硝基呋喃類藥物是人工合成的具有5-硝基呋喃基本結(jié)構(gòu)的廣譜抗菌藥物，主要包括呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃妥因、呋喃它酮[1]，常作為抗生素用于預(yù)防和治療由沙門氏菌和埃希氏菌引起的豬、牛、家禽及蜜蜂的胃腸道疾病[2]。但近年來的研究表明，硝基呋喃類藥物及其代謝產(chǎn)物具有很大的毒性，有致畸胎副作用，且能誘發(fā)癌癥，因而引起了人們的高度重視，多國已禁止了此類藥物在治療和飼料中的使用[3]。由于硝基呋喃類藥物的熱和化學(xué)不穩(wěn)定性，常以檢測其代謝產(chǎn)物作為殘留標(biāo)示物[4]。目前用來檢測呋喃妥因代謝物的最常用方法是高效液相色譜法[5-6]、液質(zhì)聯(lián)用法[3，7-8]等，由于復(fù)雜的儀器設(shè)備和繁瑣的前處理過程以及對檢驗人員的高技能要求，不適合現(xiàn)場監(jiān)控和大量樣本的篩查。因此，本文的目的是建立一種快速、靈敏地檢測動物組織中呋喃妥因代謝物殘留的酶聯(lián)免疫吸附方法（ELISA）。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雌性Balb/c小鼠 6～8周齡，清潔級，由北京勤邦生物技術(shù)有限公司實驗動物室提供；呋喃妥因代謝物（AHD）、二甲基甲酰胺、對苯二甲醛、2-硝基苯甲醛、牛血清白蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA） 美國Sigma公司；其他常規(guī)化學(xué)試劑 分析純，購自北京化學(xué)試劑公司；衍生化試劑 將15.1mg 2-硝基苯甲醛溶解于10mL甲醇中。

勻漿機8010S 上海斯伯明儀器設(shè)備有限公司；電子天平2000SBL 美國Setra公司；振蕩器KS-Ⅱ 上海躍進醫(yī)療器械廠；漩渦混合器QL-901 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；低速離心機Anke TDL-40B 上海安亭科學(xué)儀器有限公司；氮吹儀DSY-Ⅲ北京金科精華苑科技有限公司；微量移液器 單道20～200μL、100～1000μL，多道20～300μL，美國Thermo公司；生化培養(yǎng)箱DHP-600 天津市中環(huán)實驗電爐有限公司；酶標(biāo)儀MK3 美國Thermo公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 半抗原的合成 稱取1.15g AHD溶于20mL二甲基甲酰胺（DMF）中，得到A液；取5.36g對苯二甲醛溶于100mL DMF中，得到B液；室溫下將A液緩慢滴加入B液中，滴加完畢后室溫至60℃反應(yīng)2～4h，除去溶劑，柱層析純化，得到淡黃色物質(zhì)，即為呋喃妥因代謝物半抗原。

1.2.2 人工抗原的制備 免疫原的制備過程：取12mg AHD半抗原溶于1mL DMF中，得到溶液I；取40mg BSA溶于6mL水中，得到溶液Ⅱ；將溶液I滴加入溶液Ⅱ中，室溫反應(yīng)24h，得到溶液Ⅲ；取NaBH414mg用0.2mL 0.1mol/L NaOH溶解后加入溶液Ⅲ中，4℃反應(yīng)2h；用0.01mol/L磷酸緩沖液4℃透析3d，每天換液3次，以除去未反應(yīng)的小分子物質(zhì)，得到呋喃妥因代謝物免疫原；分裝，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

包被原的制備過程：取10mg AHD半抗原溶于1mL DMF中，取36mg OVA溶于7mL水中，其余步驟同免疫原的制備。

1.2.3 單克隆抗體的制備 按照常規(guī)方法免疫Balb/c小鼠制備腹水抗體，用飽和硫酸銨法純化后備用[9]。

1.2.4 抗抗體工作液的制備 以鼠源抗體為免疫原對無病原體山羊進行免疫，得到羊抗鼠抗抗體后，將其與辣根過氧化物酶（HRP）采用過碘酸鈉法[9]進行偶聯(lián)得到酶標(biāo)二抗。

1.2.5 包被抗原與抗體最佳工作濃度的確定 采用方陣滴定法，對包被抗原和抗體工作液的稀釋度進行篩選并確定，最終以零標(biāo)準(zhǔn)品OD值為1.5～2.0，0.05μg/L標(biāo)準(zhǔn)品抑制率為70%～80%時的濃度作為最佳工作濃度[10-11]。

1.2.6 酶標(biāo)板的制備 用包被緩沖液將包被原（AHD半抗原-卵清蛋白偶聯(lián)物）稀釋成0.2μg/mL，每孔加入100μL，37℃溫育2h，傾去包被液，洗滌液洗滌2次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入200μL封閉液，37℃溫育2h，傾去孔內(nèi)液體，干燥后用鋁膜真空密封保存。

1.2.7 酶聯(lián)免疫檢測方法的建立 向包被有呋喃妥因代謝物偶聯(lián)抗原的酶標(biāo)板微孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣品溶液50μL/孔，再加入單克隆抗體工作液與酶標(biāo)二抗的混合液（預(yù)先將兩者按10∶1體積比混合并混勻）50μL/孔，用蓋板膜蓋板，4℃恒溫箱中反應(yīng)30min，倒出孔內(nèi)液體，每孔加入250μL洗滌液，30s后倒出孔內(nèi)液體，如此重復(fù)操作洗板5次，用吸水紙拍干；然后加入底物顯色液A液和B液各50μL/孔，輕輕振蕩混勻，25℃恒溫避光顯色15min后，加入2mol/L終止液硫酸50μL/孔，輕輕振蕩混勻，將酶標(biāo)儀波長設(shè)定在450nm處，測定每孔吸光度值（OD值）。

1.2.8 試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 按式（1）計算百分吸光率。

式中，A為標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液的吸光度；A0為空白（濃度為0μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液）的吸光度。以呋喃妥因代謝物標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對數(shù)值為X軸，百分吸光率為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.9 樣品前處理方法的建立 用均質(zhì)器均質(zhì)樣本后，取（1.0±0.05）g的均質(zhì)物至50mL聚苯乙烯離心管中，加入4mL去離子水、0.5mL 1mol/L鹽酸溶液和100μL衍生化試劑，用振蕩器充分振蕩2min，37℃過夜孵育（大約16h）；加入5mL 0.1mol/L磷酸氫二鉀溶液、0.4mL 1mol/L氫氧化鈉溶液和5mL乙酸乙酯，用振蕩器劇烈振蕩30s，4000r/min，室溫（20～25℃）離心10min；取2.5mL上層有機相至10mL干燥玻璃試管中，于50～60℃水浴氮氣流下吹干；加入1mL的正己烷用渦旋儀渦動1min，再加入1mL復(fù)溶工作液，用渦旋儀渦動30s充分混勻后轉(zhuǎn)入2mL聚苯乙烯離心管中，4000r/min，室溫（20～25℃）離心5min；除去上層有機相，取下層水相50μL用于分析。

1.2.10 試劑盒各項技術(shù)參數(shù)的確定

1.2.1 0.1 檢測限實驗 取空白雞肉、豬肉、豬肝、蝦樣本各20份進行檢測，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出對應(yīng)于各百分吸光率的濃度，以20份樣本的濃度平均值（X）和標(biāo)準(zhǔn)差（S）表示檢測限（MDL），即MDL=X+3S。

1.2.1 0.2 精密度和準(zhǔn)確度實驗 以0.2、0.4、0.8μg/kg三個濃度的呋喃妥因代謝物標(biāo)準(zhǔn)品分別對空白雞肉、豬肉、豬肝、蝦樣品進行添加回收實驗，計算回收率和變異系數(shù)。

1.2.1 0.3 特異性實驗 試劑盒的特異性用交叉反應(yīng)率表示。按式（2）計算交叉反應(yīng)率：

其中，X為引起50%抑制的呋喃妥因代謝物濃度；Y為引起50%抑制的類似物濃度。

1.2.1 0.4 穩(wěn)定性實驗 將足量的試劑盒保存于2～8℃環(huán)境中，每隔1個月取出適量，分別測定其零標(biāo)準(zhǔn)品的OD值、IC50，及0.2、0.4、0.8μg/kg添加的雞肉、豬肉、豬肝、蝦樣本的回收率，根據(jù)實驗結(jié)果判斷試劑盒的穩(wěn)定性。

1.2.1 0.5 有效性的驗證 隨機抽取雞肉、豬肉、豬肝、蝦盲樣各20份，用本試劑盒方法與標(biāo)準(zhǔn)方法《GB/T 20752-2006豬肉、牛肉、雞肉、豬肝和水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物殘留量的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》（檢測限為0.5μg/kg）[12]分別對其進行檢測，根據(jù)實驗結(jié)果驗證試劑盒檢測實際樣本的有效性。

2 結(jié)果與分析

2.1 包被抗原與抗體的最佳工作濃度

通過方陣法實驗篩選得到：包被抗原的最佳工作濃度為1∶5000，抗體的最佳工作濃度為1∶（1.5×105）。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

按照1.2.7的步驟，分別測定濃度為0、0.05、0.1、0.3、0.6、1.2μg/L呋喃妥因代謝物標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度，采用RIDASCREEN數(shù)據(jù)分析軟件建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示，其中IC50值為0.094μg/L。

圖1 呋喃妥因代謝物的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of AHD

2.3 檢測限

根據(jù)MDL=X+3S，得該方法對雞肉、豬肉、豬肝、蝦樣本的檢測限均為0.1μg/kg。

2.4 精密度和準(zhǔn)確度

ELISA測定的精密度以變異系數(shù)表示，準(zhǔn)確度以回收率表示。取空白雞肉、豬肉、豬肝、蝦樣本，以0.2、0.4、0.8μg/kg三個濃度的呋喃妥因代謝物對其進行添加回收實驗，結(jié)果見表1。

表1 試劑盒的精密度和準(zhǔn)確度Table 1 Precision and accuracy test of the ELISA kit

由表1可知，以0.2、0.4、0.8μg/kg三個濃度水平的呋喃妥因代謝物對空白雞肉、豬肉、豬肝、蝦樣本進行添加，其加標(biāo)平均回收率范圍為78.2%～102.7%，變異系數(shù)為5.1%～11.4%，數(shù)據(jù)結(jié)果顯示試劑盒重復(fù)性較好。

2.5 特異性

結(jié)果表明，該試劑盒與呋喃妥因原藥有一定的交叉反應(yīng)，為13%，這可能是因為呋喃妥因代謝物與其原藥有類似的結(jié)構(gòu)，而對其他呋喃類藥物及代謝物的交叉反應(yīng)率均較低（＜1%），表明本試劑盒具有良好的特異性，結(jié)果見表2。

表2 試劑盒特異性實驗Table 2 Cross-reactivity test of the ELISA kit

2.6 穩(wěn)定性

結(jié)果顯示，試劑盒從生產(chǎn)之日起至第12個月，零標(biāo)準(zhǔn)品的OD值，IC50及0.2、0.4、0.8μg/kg添加的雞肉、豬肉、豬肝、蝦樣本的回收率均達到所確定的技術(shù)參數(shù)要求；隨后回收率下降至50%以下，靈敏度降低?？梢?，試劑盒穩(wěn)定性較好，可在2～8℃至少保存12個月。

2.7 有效性的驗證

通過試劑盒方法和儀器方法對隨機抽取的雞肉、豬肉、豬肝、蝦樣本進行測定，結(jié)果篩選出6份陽性樣本（含量大于0.5μg/kg），其中雞肉2份、豬肝3份、蝦1份，比較結(jié)果見表3。

由表3可知，以0.5μg/kg作為陽性判定線，LCMS/MS法對以上樣本的檢測結(jié)果均為陽性；ELISA法對以上樣本的檢測結(jié)果也為陽性，且檢測時間短（45min），用ELISA法和LC-MS/MS法的測定結(jié)果基本一致，因此ELISA方法適用于動物組織中呋喃妥因代謝物殘留的快速篩選。

3 結(jié)論

呋喃妥因作為一種硝基呋喃類藥物，因具有較大的毒性和致癌致畸的可能性，已禁止在治療和飼料中使用。但我國仍有大量養(yǎng)殖戶使用該藥物，因此建立一種敏感度高、操作簡單、成本低、適合大規(guī)模推廣的檢測方法是非常必要的。酶聯(lián)免疫方法采用特異性抗體，具有較高的精確度和靈敏度、較低的操作技術(shù)要求和短暫的檢測時間、檢測樣本量大等特點，但目前國內(nèi)外有關(guān)呋喃妥因代謝物酶聯(lián)免疫檢測的研究報道較少。

本研究成功制備出呋喃妥因代謝物單克隆抗體，初步建立了呋喃妥因代謝物酶聯(lián)免疫試劑盒檢測方法，該方法的IC50值為0.094μg/L，最低檢測限為0.1μg/kg，樣本加標(biāo)回收率范圍為78.2%～102.7%，變異系數(shù)為5.1%～11.4%，并且檢測時間短（45min），樣本前處理簡單、儀器設(shè)備投資少，檢測成本低，適合于大量樣本中呋喃妥因代謝物殘留量檢測的快速篩選，能夠更好地滿足我國畜禽養(yǎng)殖戶、屠宰場、食品企業(yè)、政府職能監(jiān)管部門等開展檢測工作。

表3 ELISA法和LC-MS/MS法檢測結(jié)果比較Table 3 Comparison determination results of ELISA with LC-MS/MS

[1]王習(xí)達，陳輝，左健中，等.水產(chǎn)品中硝基呋喃類藥物殘留的檢測與控制[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2007（18）：152-153，155.

[2]祝偉霞，劉亞風(fēng)，梁煒.動物性食品中硝基呋喃類藥物殘留檢測研究進展[J].動物醫(yī)學(xué)進展，2010，31（2）：99-102.

[3]Finzi J K，Donato J L，Sucupira M，et al.Determination of nitrofuran metabolites in poultry muscle and eggs by liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J].Journal of Chromatography B，2005，824（1/2）：30-35.

[4]佘永新，李寶海，曹維強，等.動物性食品中硝基呋喃類藥物及其代謝物殘留檢測技術(shù)的研究進展[J].現(xiàn)代科學(xué)儀器，2010（6）：149-153.

[5]Leitner A， Z?llner P， Lindner W.Determination of the metabolites of nitrofuran antibiotics in animal tissue by highperformance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J].Journal of Chromatography A，2001，939（1-2）：49-58.

[6]林黎明，林回春，劉心同，等.固相萃取高效液相色譜-質(zhì)譜法測定動物組織中硝基呋喃代謝產(chǎn)物[J].分析化學(xué)，2005，33（5）：707-710.

[7]Rodziewicz L.Determination of nitrofuran metabolites in milk by liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry[J].Journal of Chromatography B，2008，864（1/2）：156-160.

[8]Mottier P， Khong SP， Gremaud E， et al.Quantitative determination of four nitrofuran metabolites in meat by isotope dilution liquid chromatography-electrospray ionisation-tandem mass spectrometry[J].Journal of Chromatography A，2005，1067（1/2）：85-91.

[9]楊利國，胡永昶，魏平華，等.酶免疫測定技術(shù)[M].南京：南京大學(xué)出版社，1998：139-157，204-211.

[10]鞠慧麗.鹽酸克倫特羅快速檢測試劑盒的研制與開發(fā)[D].武漢：華中科技大學(xué)，2008.

[11]張道宏.氯霉素ELISA檢測試劑盒的評價及初步改進[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

[12]秦皇島出入境檢驗檢疫局.GB/T 20752-2006豬肉、牛肉、雞肉、豬肝和水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物殘留量的測定：液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2006.