李曉紅，張 慧，王德元，張 莉，邵劍文,2,*，張小平,3

(1. 安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 蕪湖 241000；2. 生物環(huán)境與生態(tài)安全安徽省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 蕪湖 241000；3. 安徽省重要生物資源保護(hù)與利用研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 蕪湖 241000)

我國特有植物青檀遺傳結(jié)構(gòu)的ISSR分析

李曉紅1，張 慧1，王德元1，張 莉1，邵劍文1,2,*，張小平1,3

(1. 安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 蕪湖 241000；2. 生物環(huán)境與生態(tài)安全安徽省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 蕪湖 241000；3. 安徽省重要生物資源保護(hù)與利用研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 蕪湖 241000)

青檀是我國特有的第三紀(jì)殘遺植物，是宣紙纖維來源的重要原材料，現(xiàn)已被列入國家Ⅲ級保護(hù)植物。采用簡單序列重復(fù)區(qū)間擴(kuò)增多態(tài)性(ISSR)標(biāo)記技術(shù)，對采自27個地理種群的628個青檀個體的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行了檢測。8對引物共得到66個清晰的擴(kuò)增位點(diǎn)，其中多態(tài)性位點(diǎn)63個，多態(tài)性位點(diǎn)百分率為95.45%。分析結(jié)果表明，青檀在物種水平上具有很高的遺傳多樣性(PPB=95.45%、Ao=1.9545、Ae=1.5729、He=0.3335、I=0.4980、Hb=0.3437)。在種群水平上的遺傳多樣性(PPB=69.98%、Ao=1.6998、Ae=1.4449、He=0.2561、I=0.3793、Hb=0.2656)和種群間遺傳分化水平(Gst=0.23，ФST=0.25)均處于中等水平。華北地區(qū)(30°—42°N)和華南地區(qū)(22°—30° N)青檀的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)的差異并不顯著。古老的起源歷史、較廣的分布范圍、異交的繁育系統(tǒng)、風(fēng)媒種子、長命的生活史以及華南和華北地形和植被的差異可能是導(dǎo)致青檀目前遺傳格局的主要原因。結(jié)合葉綠體序列(cpDNA)序列的遺傳結(jié)構(gòu)特征對青檀的保護(hù)策略進(jìn)行了探討。

青檀；ISSR；遺傳多樣性；遺傳結(jié)構(gòu)；保護(hù)策略

青檀(PteroceltistatarinowiiMaxim.)為我國特有第三紀(jì)殘遺溫帶落葉樹種，隸屬于榆科(Ulmaceae)唯一的單種屬——青檀屬 (Pteroceltis)。該樹種對氣候的適應(yīng)幅度較寬，抗逆性高，萌生能力強(qiáng)，是鈣質(zhì)土壤石灰?guī)r植物群落中的先鋒樹種，在我國的分布范圍十分廣泛，在華北、華東、華中和華南均有分布，其分布中心在華東，其中以安徽宣城、寧國、涇縣分布最為集中[1- 2]。作為我國特有的經(jīng)濟(jì)纖維樹種，青檀是“文房四寶”之首——宣紙的重要原材料(韌皮纖維)來源，已被列入國家Ⅲ級珍稀保護(hù)植物名錄[3- 4]。目前許多研究人員從不同角度對該物種進(jìn)行了相關(guān)研究，包括青檀的群落種群特征[5- 8]、種子休眠機(jī)制[9]、檀皮質(zhì)量的影響因素、化學(xué)成分、人工林的苗木培育技術(shù)[1,10]、內(nèi)生真菌[11]等方面。

了解一個物種的遺傳多樣性及其結(jié)構(gòu)不僅可以加深人們對該植物進(jìn)化歷史和適應(yīng)機(jī)制的認(rèn)識[12- 14]，還可為該植物的保護(hù)、品種選育和栽培利用提供指導(dǎo)[15- 17]。在青檀種內(nèi)遺傳多樣性的研究方面，李曉紅等2012年對代表青檀分布區(qū)的28個種群(共284個個體)的葉綠體序列 (trnS-trnG 和psbA-trnH) 進(jìn)行了分析，從母系遺傳的角度揭示了中國南部(北緯30°以南)青檀遺傳多樣性較高，種群間分化顯著，而中國北部(北緯30°以北)遺傳多樣性相對較低，種群間分化相對較小，并推測青檀在第四紀(jì)冰期可能具有多個避難所[18]。然而一個物種雙親遺傳的核基因多樣性才是該物種遺傳多樣性的主體部分，更能體現(xiàn)該物種適應(yīng)和進(jìn)化的潛力[19]。至今，有關(guān)青檀核基因的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)的研究尚不全面。Chai等利用ISSR分子標(biāo)記對安徽、山東、江蘇和河南四省5個青檀野生種群的樣品進(jìn)行了研究[20]；李建華等對湖北大貴寺國家森林公園不同海拔高度的野生青檀的種群遺傳多樣性進(jìn)行了分析[21]，這些研究使我們對青檀的核基因遺傳多樣性有了初步的了解，然而由于兩者的取樣點(diǎn)相對于青檀的整體分布區(qū)相對較少，樣點(diǎn)分布也偏于集中，因而均未能全面揭示廣布種青檀物種水平上的遺傳多樣性和分布格局。

簡單序列重復(fù)區(qū)間多態(tài)性(ISSR)是Zietkeiwitcz等于1994年發(fā)展起來的一種基于微衛(wèi)星基礎(chǔ)上的分子標(biāo)記[22]。它雖然是一種顯性遺傳標(biāo)記，不能區(qū)分純合體與雜合體，然而由于ISSR比等位酶、限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)、微衛(wèi)星(SSR)等技術(shù)簡單易行、多態(tài)性高，因而近年來應(yīng)用ISSR技術(shù)分析植物遺傳多樣性的研究已有大量報道[23- 24]。本研究采用ISSR分子標(biāo)記，在整個分布區(qū)取樣的基礎(chǔ)上，擬從核基因的角度研究：1)青檀的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)；2)中國南部和北部青檀的遺傳多樣性及其分化程度是否存在明顯的差異? 3)結(jié)合青檀的生物學(xué)特性和種群歷史，進(jìn)一步探討現(xiàn)存青檀遺傳格局的形成及維持機(jī)制，為青檀種質(zhì)資源的有效保護(hù)和栽培利用提供參考。

1 材料和方法

1.1 供試材料

根據(jù)文獻(xiàn)資料記載，2008年至2011年對青檀分布區(qū)的27個自然種群進(jìn)行了取樣，每個種群采集21—24個植株，植株間至少相隔30—50m。選取每個植株健康幼嫩的葉片3—4片，硅膠迅速干燥后保存。根據(jù)Harrison(2001)對東亞植被演替的歸納總結(jié)[25]，其中15個種群位于華北(30° — 42° N)，主要為溫帶落葉林；12個種群位于華南(22° — 30° N)，主要為溫帶常綠林。種群編號、地理位置、經(jīng)緯度、海拔高度及樣本大小詳見表1，采樣種群的地理位置分布見圖1。

圖1 青檀樣品采集分布圖 Fig.1 The sampled populations distribution of P. tatarinowii

1.2 基因組DNA的提取與聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增

采用改良十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法[26]，從硅膠干燥后的青檀葉片中提取總基因組DNA。ISSR擴(kuò)增反應(yīng)條件經(jīng)過比較和優(yōu)化確定為20 μL的反應(yīng)體系，內(nèi)含：10 × PCR緩沖液 2.0 μL，2.00 mmol/L Mg2+，0.20 mmol/L dNTP，0.40 μ mol/L引物，1.25 UTaqDNA聚合酶，模板DNA 100 ng。擴(kuò)增程序：94℃ 預(yù)變性 5 min，接著進(jìn)行35個循環(huán)：94℃ 變性 30 s，55℃ 退火 45 s，72℃ 延伸 90s，循環(huán)結(jié)束后，72℃延伸 7 min，最后 4℃ 保存。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，用含有溴化乙錠(EB)的1.5%瓊脂糖凝膠電泳，電泳緩沖液為 1 × TAE，以 DL 2000 Marker為分子量標(biāo)記，電泳后用凝膠成像系統(tǒng)拍照。位點(diǎn)的命名由所用引物和條帶的大小來確定。

1.3 引物篩選

在上海生物工程公司合成加拿大哥倫比亞大學(xué)(UBC)公布的第9套ISSR引物序列(100條)，隨機(jī)從10個種群中各選取1個個體，在20μL反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增篩選。最終從100 條引物中篩選出8 條擴(kuò)增條帶清楚、重復(fù)性好的引物(表2)用于所有個體的擴(kuò)增。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

由于ISSR為顯性標(biāo)記，電泳圖譜的每條帶都視為一個分子標(biāo)記，代表引物的一個特異結(jié)合位點(diǎn)[27]。根據(jù)各分子標(biāo)記的遷移率統(tǒng)計(jì)得到所有位點(diǎn)的二元數(shù)據(jù)，有帶(包括弱帶)記為“1”，無帶記為“0”。

采用POPGENE 1.32 計(jì)算出多態(tài)位點(diǎn)百分率(PPB)、觀測等位基因數(shù)(Ao)、有效等位基因數(shù)(Ae)、Nei′s基因多樣性(He)、Shannon′s信息指數(shù)(I)、群體總基因多樣性(Ht)、各群體間的遺傳分化指數(shù)(GST)和Nei′s遺傳距離[28]。利用不基于遺傳平衡原理的 HICKORY version 1.0[29]在f-free模型下計(jì)算種群貝葉斯遺傳多樣性 (Hb)[30]，參數(shù)為軟件默認(rèn)值。

根據(jù)Nei′s遺傳距離，利用NTSYS pc2.1軟件 的非加權(quán)配對算術(shù)平均法(UPGMA)對青檀群體間的遺傳關(guān)系進(jìn)行聚類分析[31]。采用MVSP(version 3.1)中的主成分分析(PCA)對群體的遺傳關(guān)系進(jìn)行聚類分析[32]。同時使用STRUCTURE 2.2中貝葉斯聚類法對所有個體進(jìn)行聚類分析[33]，K值設(shè)為10，5個重復(fù)，使用混合模型、burn-in為100000和run-length為1000000，根據(jù)每次運(yùn)行不同的K值對應(yīng)得lnP(D)值，計(jì)算ΔK值分析青檀可能的遺傳結(jié)構(gòu)[34]。采用Arlequin 3.0 軟件對物種水平、華南、華北地區(qū)的青檀群體內(nèi)、群體間和地區(qū)間的分子變異進(jìn)行分析[35]，進(jìn)一步檢測種群間的分化。遺傳距離和地理距離之間的相關(guān)性進(jìn)行中性檢測(Mantel test)[36]。

表2 篩選出的ISSR引物序列(5′—3′)及標(biāo)記位點(diǎn)

R=A/T, Y=C/G, D=A

圖2 UBC834引物的ISSR部分?jǐn)U增結(jié)果Fig.2 Part results of UBC834 amplification of P.tatarinowii

2 結(jié)果

2.1 遺傳多樣性

8對引物共擴(kuò)增出66條清晰、穩(wěn)定的條帶，每對引物條帶數(shù)從7—11條不等(平均為8.25)，片段大小分布在250—2500 bp之間(表2和圖2)。在物種水平上，青檀多態(tài)性位點(diǎn)百分率(PPB)高達(dá)95.45%、觀測等位基因數(shù)(Ao)為1.9545、有效等位基因數(shù)(Ae)為1.5729 、Nei′s基因多樣性(He)為0.3336、Shannon′s信息指數(shù)(I)為0.4980、貝葉斯遺傳多樣性(Hb)為0.3437(表3)。種群水平的遺傳多樣性差異較大，平均值PPB=69.98%、Ao=1.6998、Ae=1.4449、He=0.2561、I=0.3793、Hb=0.2656，最高的出現(xiàn)在甘肅天水(TS)種群(PPB=84.85%、Ao=1.8485、Ae=1.5217、He=0.3033、I=0.4516、Hb=0.3060)，最低的出現(xiàn)在廣東南嶺(NL)種群(PPB=54.55%、Ao=1.5455、Ae=1.3135、He=0.1841、I=0.2756、Hb=0.2130)。

表3 基于ISSR檢測的青檀遺傳多樣性水平

Ao: observed number of alleles per locus;Ae: effective number of alleles per locus;He: Nei′s gene diversity;I: Shannon′s information index; PPB: percentage of polymorphic loci

在地區(qū)水平上，華北地區(qū)總的多態(tài)性位點(diǎn)百分率(PPB=95.45%)、Nei′s基因多樣性(He=0.3332)、Shannon′s信息指數(shù)(I=0.4964)均略高于華南地區(qū) (PPB=93.94%、He=0.3220、I=0.4814)，但種群的平均水平兩者卻沒有顯著差異(Pgt; 0.05)。兩地區(qū)的貝葉斯遺傳多樣性(Hb)比較接近(表3)。

2.2 遺傳結(jié)構(gòu)

在物種水平上，青檀27個種群的總基因多樣性(Ht)為0.3336，其中種群內(nèi)平均遺傳變異(Hpop)為0.2561，Nei′s基因分化系數(shù)(Gst)為0.2323，表明總的遺傳變異中有23.23%來自于種群間，76.77%來自種群內(nèi)，遺傳變異主要存在于種群內(nèi)。種群間基因流(Nm)為1.6524。在地區(qū)水平上，華南地區(qū)的基因分化系數(shù)(Gst=0.2326)略高于華北地區(qū)的基因分化系數(shù)(Gst=0.2100)；華南地區(qū)的平均基因流(Nm=1.6497)略低于物種基因流平均水平(Nm=1.6524)， 而華北地區(qū)的基因流(1.8814)略高于物種整體的基因流。

分子變異分析(AMOVA)分析的結(jié)果也同樣顯示(表5)，青檀的主要遺傳變異存在于種群內(nèi)(占75.26%)，種群間具中度的遺傳分化水平(ФST=0.25)。華南和華北的遺傳多樣性也是主要存在于種群內(nèi)，但華南地區(qū)(ФST=0.26)種群間的遺傳分化水平略高于華北地區(qū)(ФST=0.23)，華南和華北之間分化很小(ФST=0.02)。

表5 青檀種群的AMOVA分析

P: the probability of null hypothesis; 1000次模擬的顯著性檢測

STRUCTURE軟件分析結(jié)果的ΔK峰值出現(xiàn)在K=2，暗示著27個青檀種群的遺傳結(jié)構(gòu)可以大致分為兩組。從圖4可以看出，當(dāng)K=2時華南和華北種群并沒有明顯分開，相比較而言LKS、NJ、ZZ、YF、LP、DA、AL、ZF、GY、NXS、LC 11個種群較相似(編號為藍(lán)色)，與NL、YS、GS、LYS種群(編號為紅色)區(qū)別較大，其它種群(編號為黒色)混雜比較明顯。

2.3 聚類分析及遺傳距離與地理距離的關(guān)系

PCA聚類分析結(jié)果(圖3)與UPGMA聚類結(jié)果(圖5)相似，青檀各種群的遺傳相似度較高，并沒有形成明顯的遺傳結(jié)構(gòu)，華南與華北地區(qū)并沒有單獨(dú)各聚在一起，而是互相摻雜。在物種水平上，遺傳距離與地理距離沒有明顯的相關(guān)性(r=0.029，Pgt; 0.05)；在地區(qū)水平上，華南地區(qū)遺傳分化與地理距離呈中度相關(guān)(r=0.307，Plt; 0.05)，而華北地區(qū)的遺傳分化和地理距離不具相關(guān)性(r=-0.066，Pgt; 0.05)。

圖3 青檀27個種群的主成分分析(PCA)分析Fig.3 PCA analysis of 27 populations of P. tatarinowii

圖4 K=2時貝葉斯聚類法的分析結(jié)果Fig.4 Histogram of the bayesian analysis with K=2 using STRUCTURE

3 討論

3.1 青檀的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)

本文對代表青檀整個分布區(qū)的27個自然種群共628個個體遺傳多樣性分析顯示，青檀在物種水平上具有很高的遺傳多樣性，其多態(tài)位點(diǎn)百分率(PPB)達(dá)到95.45%，明顯高于Nybom 和Bartish對107個物種總結(jié)的平均遺傳多樣性(PPB=71.02%)[37]，也明顯高于一般木本植物的遺傳多樣性，如銀杏PPB=70.45%[38]、長果秤錘樹PPB=72.99%[39]、思茅木姜子PPB=87.01%[40]、板栗PPB=87.07%[41]等。Chai X Y和李建華對局部區(qū)域青檀的遺傳多樣分析的結(jié)果也揭示了類似的結(jié)果(Chai X Y: PPB=100%; 李建華：PPB=92.14% )。青檀種群內(nèi)的遺傳多樣性(PPB=69.98%、Hpop=0.260、I=0.380)和種群間遺傳分化程度(Gst=0.23，ФST=0.25)均處于中等水平，與異花傳粉植物(Hpop=0.260,Gst=0.23，ФST=0.28)、種子風(fēng)媒植物(Hpop=0.261,Gst=0.23，ФST=0.25)和長命植物(Hpop=0.242,Gst=0.23，ФST=0.25)的平均水平十分接近[38]。

圖5 青檀種群間Nei′s遺傳距離建立的非加權(quán)配對算術(shù)平均法(UPGMA)聚類圖Fig.5 Dendrogram of populations of P. tatarinowii generated from UPGMA cluster analysis according to Nei′s genetic distance有下劃線的為北方種群，余為南方種群; 節(jié)點(diǎn)處數(shù)字代表gt;50%支持率

一個物種現(xiàn)有的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)是由其自身因素和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果，其中包括物種進(jìn)化歷史、交配系統(tǒng)、基因流、基因漂變、地理分布等[37,42]。相對于青檀而言，古老的起源歷史、較廣的分布、異交的繁育系統(tǒng)、風(fēng)媒種子及長命的生活史可能是其目前仍維持著較高遺傳多樣和中度遺傳分化水平的主要原因。青檀是第三紀(jì)的孑遺植物[18]，漫長的進(jìn)化歷史在時間尺度上為其基因突變、重組和變異積累提供了可能。此外，青檀主要分布于石灰?guī)r地帶，范圍較為廣泛，涵蓋我國19個省市，大尺度的地理跨度、生境和氣候的異質(zhì)性為青檀遺傳多樣性提供了孕育場所。在繁殖方式上，青檀既可依靠有性繁殖也可依靠無性繁殖進(jìn)行種群的自然更新。青檀雌雄異花同株、無花瓣，花絲直立將花藥撐起、先花后葉等特征都有利于花粉借助風(fēng)力散布；而且其種子兩側(cè)具薄寬翅，能借助自然風(fēng)力進(jìn)行較遠(yuǎn)距離傳播[2]。因而這些特征十分有助于青檀各種群間的基因交流，維持了較大有效種群，可減小遺傳漂變的影響[43]。另外，青檀是一種典型的長命木本植物，種群中具有多個世代、世代更替慢也可能是它維持現(xiàn)有遺傳結(jié)構(gòu)的原因之一[37,44]。

3.2 華南與華北地區(qū)青檀遺傳多樣性與遺傳結(jié)構(gòu)的差異

青檀是典型的落葉闊葉樹種，現(xiàn)主要分布于我國華北(30°—42°N)的溫帶落葉林中和華南 (22°—30° N) 亞熱帶常綠闊葉林中[2, 25]。李曉紅等采用母系遺傳的cpDNA序列研究發(fā)現(xiàn)兩種植被下青檀的遺傳結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)明顯差異，華北地區(qū)細(xì)胞質(zhì)基因的遺傳多樣性(hT=0.32，πT=0.00064)明顯低于華南地區(qū)的(hT=0.85，πT=0.00453)，前者種群間的遺傳分化水平(ФST=0.69)也明顯低于后者(ФST=0.97)[18]。本文基于ISSR遺傳標(biāo)記研究顯示，在核基因上，雖然華北地區(qū)的青檀遺傳分化水平(ФST=0.22)略低于華南地區(qū)(ФST=0.25)，前者總遺傳多樣性水平(PPB=95.45%,h=0.3332,I=0.4964)也略高于后者(PPB=93.94%,He=0.3220,I=0.48140)，但種群水平的平均遺傳多樣性兩者差異并不顯著。青檀這種華南和華北地區(qū)間遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)差異形成的主要原因可能是：華南地區(qū)(22°—30°N)地形復(fù)雜，存在多條明顯的山脈，而華北地區(qū)(30°—42°N)青檀分布區(qū)地形平坦、沒有山脈的阻礙，這種地形的差異已對種子的風(fēng)媒傳播產(chǎn)生了一定的影響，導(dǎo)致南部種子傳播受到限制，種群間母系遺傳的隔離明顯，由于遺傳漂變的原因，突變的單倍型易被保留下來(單倍型多樣性較高，華南hT=0.85明顯高于華北hT=0.32)，種群間分化更明顯(華南ФST=0.97高于華北ФST=0.69)，然而這種地形差異目前對花粉流的影響還較低，還沒有導(dǎo)致核基因遺傳多樣性與遺傳結(jié)構(gòu)上產(chǎn)生明顯的差異[45]。這種地形的差異對種子流和花粉流的影響不同也可能是導(dǎo)致華南地區(qū)遺傳分化與地理距離呈中度相關(guān)(r=0.307，Plt; 0.05)而華北地區(qū)的遺傳分化和地理距離不具相關(guān)性(r=-0.066，Pgt;0.05)的主要原因。

3.3 保護(hù)建議

青檀是我國特有的經(jīng)濟(jì)纖維樹種，它是宣紙的重要原材料(韌皮纖維)來源，現(xiàn)已被列入國家Ⅲ級珍稀保護(hù)植物名錄[4]。物種保護(hù)的主要內(nèi)容是保護(hù)其遺傳多樣性及進(jìn)化潛力，種內(nèi)遺傳多樣性愈豐富，物種對環(huán)境變化的適應(yīng)能力愈強(qiáng)，其進(jìn)化潛力愈大[46]。鑒于青檀在物種水平上仍維持著較高的遺傳多樣性，而且遺傳多樣性主要存在于種群內(nèi)，因此我們認(rèn)為青檀野生種群仍具有較高的進(jìn)化潛力和適應(yīng)能力，目前保護(hù)仍要以就地保護(hù)為主。考慮到青檀種群間已存在一定的遺傳分化，要盡可能保護(hù)現(xiàn)所有的野生種群，尤其要注意對遺傳多樣性較高的種群(TS、JX、QY)和具有獨(dú)特單倍型的種群(XA、SD、ML、NXS、LP、YF、WYS、GL、AL)優(yōu)先保護(hù)詳見Li,2012，必要時可以設(shè)置專門的保護(hù)區(qū)或保護(hù)點(diǎn)。此外，華南地區(qū)青檀種群由于與常綠闊葉林混生，建議可以選擇性間伐部分常綠闊葉樹種，開辟林窗以增強(qiáng)林下透光率，以利于青檀幼苗的生長和花粉及種子的散布，進(jìn)而增加種群間的基因流。在人工林建立和種質(zhì)資源庫建立時，可以優(yōu)先考慮上述重點(diǎn)保護(hù)的種群作為采樣點(diǎn)，同時考慮到華南地區(qū)遺傳多樣性低于華北地區(qū)，而遺傳分化高于華北地區(qū)，華南地區(qū)要在盡可能多的種群內(nèi)收集種子或幼苗，華北地區(qū)則可以選擇部分代表性的種群進(jìn)行取樣。

[1] Fang S Z, Li G Y, Fu X X. Biomass production and bark yield in the plantations ofPteroceltistatarinowii. Biomass and Bioenergy, 2004, 26(4): 319- 328.

[2] Fang S Z, Fu X X.PteroceltistatarinowiiMaxim in China. Beijing: Chinese Science and Culture Press, 2007.

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ThegeneticstructureofendemicplantPteroceltistatarinowiibyISSRmarkers

LI Xiaohong1，ZHANG Hui1，WANG Deyuan1, ZHANG Li, SHAO Jianwen1,2,*, ZHANG Xiaoping1,3

1CollegeofLifeScience,AnhuiNormalUniversity,Wuhu241000 2TheKeyLaboratoryofBioticEnvironmentandEcologicalSafetyinAnhuiProvince,AnhuiNormalUniversity,Wuhu241000 3TheKeyLaboratoryofConservationandEmploymentofBiologicalResourcesofAnhui,Wuhu241000

PteroceltistatarinowiiMaxim. (Ulmaceae), a tertiary relict plant of a temperate deciduous tree species endemic to China, is widely distributed in bare limestone mountains across the mainland in China. The bark (phloem fiber) of this plant has long since been used as the sole raw material for manufacturing Chinese traditional Xuan Paper. However, the species are subject to many threats due to its distribution pattern characterized by small patches; its decreasing population size resulted from overexploitation, and reduction of the original forest ecosystem. Thus, it has now been listed as a rare and endangered plant (National Grand III) in China.

Using inter-simple sequence repeat markers, the genetic diversity and structure of 628 individuals from 27 populations ofP.tatarinowiiwere detected. A total of 66 bands, of which 63 were polymorphic, were presented from the 8 selected primers screening across all samples, with the percentage of polymorphic bands up to 95.45%. The result of POPGENE revealed quite high level genetic diversity for the plant at the species level (PPB=95.45%,Ao=1.9545,Ae=1.5729,He=0.3335,I=0.4980). At the population level, TS population from Gansu harbored the highest genetic diversity (PPB=84.85%,Ao=1.8485,Ae=1.5217,He=0.3033,I=0.4516), whereas NL population from Guangdong with the lowest genetic variation (PPB=54.55%,Ao=1.5455,Ae=1.3135,He=0.1841,I=0.2756). The mean population genetic level (PPB=69.98%,Ao=1.6998,Ae=1.4449,He=0.2561,I=0.3793) and population genetic differentiation ofP.tatarinowii(Gst=0.23，ФST=0.25) were both at the middle level compared to other species. Gene flow (Nm) was estimated to be 1.65. In addition, different genetic variation and patterns were found between North China and South China. Populations of North China presented higher genetic diversity (PPB=95.45%,He=0.3332,I=0.4964) and lower genetic differentiation (ФST=0.22) than those of South China (PPB=93.94%,He=0.3220,I=0.4814 and ФST=0.25). It would seem the extant genetic pattern ofP.tatarinowiiwas might mainly attributed to its long evolutionary history, wide-ranging distribution, outcross mating system, long life cycle and complex differences of terrain and vegetation between North China and South China.

According to our aforementioned results and the evidence from our cpDNA data,insituconservation was the preferred way to maintain the species′ high level genetic diversity. Especially, much more attention should be paid to populations with higher genetic diversity (TS, JX and QY) and populations harboring peculiar cpDNA haplotypes (XA,SD,ML,NXS,LP,YF,WYS,GL,AL). In the condition of establishment of artificial plantation and germplasm bank, the above peculiar populations should been given prior consideration. Regarding the genetic pattern difference between South China and North China, more populations in South China and fewer representative populations with more individuals in North China should been sampled to obtain the utmost genetic diversity ofP.tatarinowii.

Pteroceltistatarinowii; inter-simple sequence repeat(ISSR); genetic diversity; genetic structure; conservation strategies

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30970292, 30840020)

2012- 12- 12;

2013- 06- 03

*通訊作者Corresponding author.E-mail: shaojw@mail.ahnu.edu.cn

10.5846/stxb201212191825

李曉紅，張慧，王德元，張莉，邵劍文，張小平.我國特有植物青檀遺傳結(jié)構(gòu)的ISSR分析.生態(tài)學(xué)報,2013,33(16):4892- 4901.

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