鄭春芳，劉偉成，陳少波，仇建標(biāo)，黃 麗，彭 欣，黃曉林，王 寧

(浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所，浙江省近岸水域生物資源開發(fā)與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，溫州海洋研究院，溫州 325005)

短期夜間低溫脅迫對秋茄幼苗碳氮代謝及其相關(guān)酶活性的影響

鄭春芳，劉偉成，陳少波*，仇建標(biāo)，黃 麗，彭 欣，黃曉林，王 寧

(浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所，浙江省近岸水域生物資源開發(fā)與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，溫州海洋研究院，溫州 325005)

-2℃夜間低溫處理秋茄幼苗12 h后，白天溫度升高到5℃再低溫處理4 h，研究了低溫16 h處理對秋茄幼苗葉片光合特性、色素含量、抗氧化系統(tǒng)、細(xì)胞膜透性以及碳氮代謝相關(guān)酶活性的影響。結(jié)果表明：(1)低溫16 h內(nèi)，秋茄的凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、氣孔限制值均顯著降低，而胞間CO2濃度顯著增加。(2)低溫低于8 h，葉片葉綠素含量、類胡蘿卜素含量以及Chl a/Chl b比值均未產(chǎn)生顯著變化，而Car/Chl 比值顯著增加。低溫12、16 h，其葉片光合色素均下降，尤其白天下降幅度更大。(3)低溫16 h內(nèi)葉片可溶性總糖一直增加，而蔗糖含量、蔗糖合成酶(SS)和蔗糖磷酸合成酶(SPS)活性均在低溫12 h后下降。(4)低溫16 h內(nèi)葉片可溶性蛋白、游離氨基酸含量以及羧肽酶活性均增加，而低溫8 h時葉片內(nèi)肽酶活性就開始下降。(5)低溫16 h內(nèi)葉片相對電導(dǎo)率、MDA均增加，而葉片POD活性均下降，尤其夜間下降更明顯。另外，低溫4、16 h能顯著降低葉片SOD活性。以上說明，低溫16 h時秋茄葉片光合作用的下降主要是因?yàn)榉菤饪讓?dǎo)度限制引起，這主要與光合色素下降、抗氧化酶活性降低有關(guān)。此外，短期夜間低溫通過影響SS、SPS、內(nèi)肽酶以及羧肽酶活性，從而抑制了秋茄自身的碳氮代謝調(diào)控能力。

秋茄；短期夜間低溫；光合作用；蔗糖代謝相關(guān)酶；蛋白水解酶

光合作用是植物最基本的生命活動，也是植物合成有機(jī)質(zhì)和獲取能量的根本來源，而夜間低溫降低了植物CO2同化率[1]，導(dǎo)致電子難以傳遞到其后的電子傳遞體上，使得整個光合電子傳遞過程受阻，光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)功能下降[2]。另外，夜間低溫也直接影響了白天植物光合產(chǎn)物的水解[3]，而植物白天所得到的光合產(chǎn)物大部分以蔗糖的形式供應(yīng)和運(yùn)輸，其中蔗糖合成酶(SS)和蔗糖磷酸合成酶(SPS)不但是蔗糖代謝的關(guān)鍵酶，也是光合產(chǎn)物向蔗糖分配的關(guān)鍵調(diào)控點(diǎn)，直接影響植物的生長發(fā)育和光合產(chǎn)物分配[4]。研究發(fā)現(xiàn)，夜間低溫抑制了黃瓜第2天的光合作用，反而提高了蔗糖和SPS活性[5]。也有人認(rèn)為夜間低溫對玫瑰葉片中SS和SPS的活性影響因葉片發(fā)育程度不同而存在差異[6]。此外，齊紅巖等也指出番茄蔗糖含量、SS和SPS活性對短期夜間低溫效應(yīng)因不同低溫類型而變化不同[7]。因此，短期夜間低溫對植物碳代謝的影響是極為復(fù)雜的。

植物碳代謝與氮代謝關(guān)系密切，碳氮代謝的強(qiáng)度和平衡關(guān)系直接影響植物生長發(fā)育，因而參與氮代謝過程相關(guān)酶活性變化又是影響植物器官建成的關(guān)鍵。其中，內(nèi)肽酶和羧肽酶是植物體內(nèi)主要的蛋白水解酶，其活性高低影響了營養(yǎng)器官儲存氮素的再利用程度[8]。目前，有關(guān)低溫對植物氮代謝的研究甚少，且主要集中在氮素的同化方面[9- 10]，而低溫對植物內(nèi)肽酶和羧肽酶活性影響的研究卻未見報道。

秋茄(Kandeliacandel)是最耐寒的紅樹植物，也是我國分布最廣的紅樹林種類，但全球氣候變化引起的極端低溫仍影響著秋茄的成活和生長，這成為我國紅樹林人工高緯度引種能否成功的主要因子之一。因此，如何提高秋茄抗寒性，維持低溫條件下紅樹林的存活就成為紅樹林造林的關(guān)鍵。近年來，有關(guān)低溫對紅樹林生理特征的影響研究有了一些相關(guān)報道。楊盛昌和林鵬[11]從抗寒力與水分、葉綠素、可溶性蛋白質(zhì)含量及抗氧化酶活性的相關(guān)性探討了秋茄的抗低溫適應(yīng)機(jī)制。陳鷺真等[12]系統(tǒng)調(diào)查了2008年極端氣候?qū)θA南沿海各省的紅樹林區(qū)造成不同程度傷害。最近，雍石泉等又發(fā)現(xiàn)2010年冬季持續(xù)寒冷天氣條件下閩江河口濕地引種秋茄可溶性總糖含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、過氧化物酶(POD)活性均高于無瓣海桑和拉關(guān)木。然而，關(guān)于短期夜間低溫影響紅樹林碳氮代謝的研究卻甚少。因此，本研究以1年生秋茄幼苗為材料，較為系統(tǒng)地研究了短期夜間低溫對植株光合功能、碳氮代謝相關(guān)酶活性影響，以期闡明秋茄幼苗碳氮代謝對夜間短期低溫的響應(yīng)機(jī)制，為抗寒紅樹植物品種的選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及其處理

2011年4月，插種秋茄胚軸于裝有灘涂泥的塑料營養(yǎng)杯內(nèi)，擺放在有潮水浸泡的溫州龍灣區(qū)灘涂上，并做好保護(hù)措施。秋茄生長于青紫塥粘土，母質(zhì)為近代淺海與江涂沉積物，質(zhì)地輕粘，土壤pH值7.1，有機(jī)質(zhì)2.8 g/kg，堿解氮111.2 mg/kg，速效磷(P2O5)35.1 mg/kg，速效鉀(K2O)670.0 mg/kg，氯化鈉1.18 g/kg。在2012年1月10日，選取大小基本一致的1年生秋茄幼苗移植到高為30cm，直徑為20cm的聚乙烯塑料桶內(nèi)，并裝入灘涂淤泥自然風(fēng)干土3.0kg。在自然環(huán)境下培養(yǎng)20 d，澆灌Hoagland′s營養(yǎng)液(NaCl濃度為10‰)。每桶幼苗3株。在智能光照培養(yǎng)箱內(nèi)預(yù)培養(yǎng)14 d，設(shè)定溫度20℃(夜)/25℃(晝)，光照每天12 h，光照強(qiáng)度300μmol·m-2·s-1，相對濕度70%，定期澆灌，保持水層1—2 cm。

夜間處理：夜溫設(shè)為20℃(對照)和-2℃，處理時間為19：00―23：00、23：00―翌日3：00、3：00―7：00，無光照，對照相對濕度不變，而低溫相對濕度為60%―70%。白天對照溫度由20℃升溫到25℃，低溫-2℃升溫到5℃，處理時間為7：00―11：00，對照和低溫處理的相對濕度和光照條件均分別為70%和300 μmol·m-2·s-1。選擇頂端完全展開的倒二對葉片用于光合、生理測定，每次每個處理取3盆，作為3個重復(fù)。其中，光合參數(shù)僅在低溫16 h時測定，而其他指標(biāo)均在低溫4、8、12以及16h測定。

1.2 測定項(xiàng)目與方法

1.2.1 光合參數(shù)的測定

在自然光照條件下(外界溫度為13℃左右)恢復(fù)30 min，測定光合參數(shù)。用Li- 6400型便攜式光合儀于10：30—11：30測定頂端完全展開的倒二對葉片的凈光合速率(Pn)、細(xì)胞間隙CO2濃度(Ci)、氣孔導(dǎo)度(Gs)、氣體交換參數(shù)，并根據(jù)Ls=1-Ci/Ca計算葉片氣孔限制值(Ls)，式中Ca為環(huán)境CO2濃度。測定時設(shè)定光合有效輻射(PAR)為600 μmol·m-2·s-1(接近外界自然環(huán)境光強(qiáng))，CO2濃度均為(410±3)μmol/mol，葉片溫度為15℃，光量子通量密度(PFD)為500 μmol·m-2·s-1。

1.2.2 光合色素的測定

稱取0. 1 g葉片，分別剪成數(shù)段放入25 mL無水乙醇和丙酮(1∶1)提取液中，在25 ℃黑暗條件下提取24 h，測定提取液在665、649和470 nm處的吸光值，參照李合生[14]方法計算葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素以及類胡蘿卜素含量。

1.2.3 超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)活性和丙二醛(MDA)含量的測定

按Tan等[15]方法測定，分別取0.5 g葉片，加5 mL 50 mmol/L pH7.0磷酸提取液冰浴研磨，4 ℃ (10000×g)離心30 min，上清液為待測提取液。用氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT)法，560 nm 比色測定SOD活性；愈創(chuàng)木酚法測定POD活性；按Du和Bramlage[16]方法測定MDA含量。

1.2.4 可溶性總糖、蔗糖、游離氨基酸以及可溶性蛋白含量的測定

采用蒽酮法[17]測定幼苗各器官的可溶性總糖含量，間苯二酚法測定蔗糖含量[18]，采用茚三酮比色法[13]測定游離氨基酸含量，采用考馬斯亮藍(lán)G- 250染色法[19]。

1.2.5 蔗糖合成酶(SS)和蔗糖磷酸合成酶(SPS)測定

參考湯章城[20]方法測定。取0.5 g葉片放入預(yù)冷的研缽中，研缽置于冰盒上。加入3 mL提取緩沖液于研缽中快速研磨成均勻糊狀后，用2 mL提取介質(zhì)清洗研缽兩次，倒入4層紗布過濾，濾液定容至5 mL，4 ℃(12000×g)離心10min，取上清液進(jìn)行SS和SPS酶活性測定。酶的活性單位為蔗糖μmol·g-1鮮重·h-1。

1.2.6 內(nèi)肽酶和羧肽酶活性的測定

酶液提取和測定采用王東等[21]的方法。0.3 g鮮樣加Tris-HCl緩沖液5 mL(pH 7.5，內(nèi)含4 mmol/L DTT，1 mmol/L EDTA，1% PVP)冰浴研磨，4℃下15000×g離心30 min，上清液用于茚三酮反應(yīng)，在570 nm下測內(nèi)肽酶和羧肽酶活性。酶活性以單位反應(yīng)時間內(nèi)生成的氨基酸量表示。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS和SigmaPlot10.0軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和顯著性測驗(yàn)。數(shù)據(jù)結(jié)果為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean ± SD)。

2 結(jié)果與分析

2.1 短期夜間低溫脅迫對秋茄幼苗葉片光合參數(shù)、光合色素的影響

由表1可知，與對照相比，低溫脅迫處理顯著降低了凈光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)以及氣孔限制值(Ls)(Plt;0.05)，卻顯著提高了胞間CO2濃度(Ci)(Plt;0.05)。

表1 短期夜間低溫對秋茄幼苗葉片光合參數(shù)的影響

同列不同小寫字母表示不同處理之間達(dá)顯著性差異(Plt;0.05)

圖1 短期夜間低溫脅迫對秋茄幼苗葉片光合色素的影響Fig.1 Effects of short-term dark chilling on leaves photosynthetic pigments in Kandelia obovata seedling不同小寫字母表示不同處理之間達(dá)到顯著性差異(Plt;0.05)

由圖1可知，秋茄幼苗葉片葉綠素、類胡蘿卜素含量均隨生育時間延長而增加。與對照相比，夜間低溫脅迫4 h時，葉綠素、類胡蘿卜素含量均增加，但未達(dá)到顯著水平；當(dāng)?shù)蜏孛{迫8 h時，葉綠素含量開始下降，而類胡蘿卜素含量還在增加；當(dāng)?shù)蜏孛{迫12 h時，葉綠素、類胡蘿卜素含量均開始下降，但僅后者存在顯著差異(Plt;0.05)；當(dāng)?shù)蜏孛{迫16 h時，葉綠素、類胡蘿卜素含量分別下降14.9%和26.8%，均達(dá)到顯著水平(Plt;0.05)。

在夜間，秋茄幼苗葉片葉綠素a/葉綠素b比并未隨時間延長而產(chǎn)生較大變化，且處理間無顯著差異，而白天時低溫處理下其比值顯著降低(Plt;0.05)。與葉綠素a/葉綠素b比變化趨勢一樣，無脅迫條件下秋茄幼苗葉片類胡蘿卜素/葉綠素比變化平緩，但在連續(xù)16 h低溫處理下其比值存在不同的變化差異。與對照相比，低溫脅迫4、8 h時其比值升高，且在8 h時達(dá)到顯著水平(Plt;0.05)，而低溫脅迫12、6 h時其比值又迅速下降，分別降低了26.2%和19.8%，均達(dá)到顯著水平(Plt;0.05)。表明，夜間低溫對秋茄幼苗葉片類胡蘿卜素影響較葉綠素更顯著。

2.2 短期夜間低溫脅迫對秋茄幼苗葉片可溶性總糖、蔗糖及其相關(guān)酶活性的影響

圖2 短期夜間低溫脅迫對秋茄幼苗葉片可溶性總糖、蔗糖、蔗糖合成酶以及蔗糖磷酸合成酶活性的影響Fig.2 Effects of short-term dark chilling on leaves contents of total soluble sugar and sucrose and activities of SS and SPS in Kandelia obovata seedling

秋茄幼苗葉片可溶性總糖、蔗糖含量均隨生長時間延長呈先降后升的趨勢(圖2)。與對照相比，低溫處理提高了秋茄幼苗葉片可溶性總糖，且在低溫12、16 h時分別增加13.5%和39.5%，均達(dá)到顯著差異(Plt;0.05)。與對照相比，蔗糖含量僅在低溫8 h時顯著增加(Plt;0.05)，而隨著低溫時間延長其含量又迅速下降，且在低溫12、16 h時分別比對照減少27.8%和14.6%，均達(dá)到顯著水平(Plt;0.05)。秋茄幼苗葉片蔗糖合成酶和蔗糖磷酸合成酶活性隨生長時間延長呈先增后降的趨勢(圖2)，低溫處理并未改變兩種酶活性的變化趨勢，但與對照之間仍存在不同差異。與對照相比，低溫4 h時蔗糖合成酶迅速升高，而8 h時其酶活性又恢復(fù)正常。然而，當(dāng)?shù)蜏貢r間持續(xù)到12、16 h時，其酶活性又迅速下降，并分別降低為對照的75.2%和51.9%，均達(dá)到顯著差異(Plt;0.05)。與對照相比，低溫條件下秋茄幼苗葉片蔗糖磷酸合成酶活性一直下降，當(dāng)?shù)蜏?2、16 h時其酶活性下降為對照的68.8%和78.5%，均達(dá)到顯著差異(Plt;0.05)。

2.3 短期夜間低溫脅迫對秋茄幼苗葉片可溶性蛋白、游離氨基酸及其相關(guān)酶活性的影響

正常情況下夜間秋茄幼苗葉片可溶性蛋白質(zhì)含量變化較平緩，而白天其含量迅速升高(圖3)。其中低溫4、8、12和16 h時其可溶性蛋白質(zhì)含量均升高，分別為對照的1.4、1.2、1.4和1.2倍，均達(dá)到顯著水平(Plt;0.05)。與可溶性蛋白質(zhì)含量變化不同，秋茄幼苗葉片游離氨基酸含量隨生長時間延長呈先降后升的趨勢(圖3)。當(dāng)?shù)蜏? h 和16h時，其含量分別為對照的1.2和1.1倍，均達(dá)到顯著水平(Plt;0.05)，而低溫8 h 和12h時其含量與對照間并未有顯著差異。

圖3 短期夜間低溫脅迫對秋茄幼苗葉片可溶性蛋白質(zhì)、游離氨基酸、內(nèi)肽酶以及羧肽酶活性的影響Fig.3 Effects of short-term dark chilling on leaves contents of soluble protein and free amino acid and activities of endoptidase and carboxypeptidase in Kandelia obovata seedling

無脅迫條件下秋茄幼苗葉片內(nèi)肽酶活性與可溶性蛋白質(zhì)含量變化一致(圖3)。低溫處理?xiàng)l件下內(nèi)肽酶活性出現(xiàn)了較大變化。當(dāng)?shù)蜏? h時，其酶活性迅速升高，為對照的1.6倍，達(dá)到顯著水平(Plt;0.05)，而低溫8、12和16 h時其酶活性又均下降，分別為對照的77.9%、80.6%和77.8%，均達(dá)到顯著差異(Plt;0.05)。無脅迫條件下秋茄幼苗葉片羧肽酶活性呈先增后降的趨勢，且夜間其酶活性高于白天(圖3)。低溫處理能提高秋茄幼苗葉片羧肽酶活性，僅當(dāng)?shù)蜏? h和16h時，才與對照有顯著差異(Plt;0.05)。

2.4 短期夜間低溫脅迫對秋茄幼苗葉片相對電導(dǎo)率和抗氧化系統(tǒng)的影響

無脅迫條件下秋茄幼苗葉片相對電導(dǎo)率隨時間延長呈增加趨勢(圖4)。與對照相比，低溫4、8、12和16 h時其相對電導(dǎo)率分別增加16.9%、10.1%、16.8%和9.8%，均達(dá)到顯著水平(Plt;0.05)。夜間秋茄幼苗葉片MDA含量與相對電導(dǎo)率變化趨勢一致，但白天時其含量迅速下降(圖4)。夜間低溫處理提高了MDA含量，但與對照間無顯著差異，而白天時MDA含量顯著增加(Plt;0.05)。

圖4 短期夜間低溫脅迫對秋茄幼苗葉片相對電導(dǎo)率、丙二醛含量、SOD和POD酶活性的影響Fig.4 Effects of short-term dark chilling on leaves relative conductive, MDA content and activities of SOD and POD in Kandelia obovata seedling

秋茄幼苗葉片SOD活性隨生長時間延長呈先降后升，而POD活性卻表現(xiàn)相反(圖4)。與對照相比，低溫4 h時其SOD活性顯著下降，而低溫8 h時其活性又迅速提高，但與對照間無顯著差異。與對照相比，低溫12 h時SOD活性開始下降，并在低溫16 h時其活性下降為對照的91.1%，達(dá)到顯著水平(Plt;0.05)。低溫處理降低了秋茄幼苗葉片POD活性，與對照相比，夜間低溫4、8和12 h時其POD活性分別下降了18.0、16.7 和30.3%，均達(dá)到顯著水平(Plt;0.05)，而低溫16 h時其POD活性與對照間無顯著差異。

3 結(jié)論與討論

3.1 短期夜間低溫條件下秋茄幼苗葉片光合特征

Kao等[22]研究不僅發(fā)現(xiàn)低溫1 h降低了秋茄凈光合速率和氣孔導(dǎo)度，而且還指出光飽和速率下降的原因是因?yàn)榈蜏卣T導(dǎo)氣孔關(guān)閉所致。楊盛昌等[23]也指出5℃夜間低溫13 h條件下秋茄凈光合速率的降低與氣孔導(dǎo)率減少密切相關(guān)。在逆境脅迫下，引起植物葉片光合速率降低的原因主要分為氣孔限制和非氣孔限制兩類。根據(jù)Farquhar和Sharkey[24]的觀點(diǎn)，認(rèn)為Ci和Ls這兩個指標(biāo)就可以來判斷光合作用的限制因素：當(dāng)Ci和Pn均減少，且Ls增大時，氣孔因素為限制因子；否則，當(dāng)Pn下降，Ci升高，且Ls減少，植物光合能力的降低則為非氣孔限制。本研究中，低溫16 h時秋茄幼苗葉片Pn和Gs均顯著降低，Ci顯著升高，Ls則顯著減少，這表明短期低溫處理下，秋茄幼苗葉片光合速率下降主要受非氣孔因素限制。非氣孔限制因素可能是由于CO2固定能力、光合色素含量、光合作用關(guān)鍵酶等因素的改變，致使葉肉細(xì)胞光合活性下降，引起Rubisco含量減少[25]。

Chla/Chlb比值的變化可以反映紅樹林抗寒力的越冬變化[11]。這主要因?yàn)椋耗婢硹l件下Chla/Chlb比值的降低能反映出類囊體膜的垛疊程度降低，而膜垛疊的減少降低了植物對光量子的有效吸收、傳遞和利用，導(dǎo)致光能轉(zhuǎn)化為生物化學(xué)能的效率降低[28]。另外，Car/Chl比值是與植物清除活性氧的能力和忍受逆境的能力有關(guān)[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，低溫降低了Chl和Car含量，且在白天的時候尤其顯著，表明白天低溫嚴(yán)重抑制了秋茄幼苗葉片葉黃素循環(huán)，提高了葉綠素酶活性，促進(jìn)葉綠素水解，這不同于陳鷺真等[30]研究，可能是與處理的材料、方式有關(guān)。此外，低溫降低了秋茄幼苗葉片Chl a/Chl b比，而提高了低溫4、8 h時葉片的Car/Chl比值，表明夜間低溫減少秋茄幼苗葉片Chl的相對速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于Car，這可能是極性分子受到明顯影響，產(chǎn)生了色素交互作用[31]。當(dāng)?shù)蜏靥幚?6 h時，秋茄幼苗葉片Chl a/Chl b、Car/Chl比均降低，表明秋茄白天受到低溫脅迫影響后，其基粒類囊體垛疊數(shù)目迅速減少，葉綠素含量也快速降低。另一方面，白天溫度上升到5 ℃后，盡管葉片Car/Chl比值減少，但并意味著低溫體內(nèi)的活性氧減少了，而是因?yàn)榘滋斓蜏貤l件下葉綠素合成速度高于類胡蘿卜素，并結(jié)合清除ROS的酶活性變化，發(fā)現(xiàn)夜間-2 ℃脅迫加劇了白天葉綠素的光氧化破壞。

3.2 短期夜間低溫條件下秋茄幼苗葉片糖代謝特征

通常在植物葉片光合速率高、呼吸速率低、光合運(yùn)轉(zhuǎn)能力弱的條件下易出現(xiàn)總糖、淀粉、蔗糖、葡萄糖以及果糖的大量積累，而研究發(fā)現(xiàn)，陸地植物番茄在低溫條件下不同糖類的累積與光合作用無關(guān)，但卻與庫源關(guān)系的改變以及其代謝相關(guān)的SS和SPS活性變化有關(guān)[32]。本研究發(fā)現(xiàn)，低溫4、8 h時秋茄葉片可溶性總糖、蔗糖開始積累，同時，秋茄葉片SS活性也輕微上升，而SPS活性持續(xù)下降。表明，短期夜間低溫條件下葉片SS起促進(jìn)蔗糖合成的作用，且作用較大于SPS。當(dāng)?shù)蜏?2、16 h時，秋茄葉片可溶性總糖仍顯著上升，但蔗糖開始顯著下降，同時葉片SS、SPS活性也均顯著下降，這又說明一方面低溫抑制葉片中糖類(果糖、葡萄糖)向蔗糖的合成，導(dǎo)致總糖含量的積累，另一方面又抑制蔗糖合成酶(SS、SPS)活性，導(dǎo)致蔗糖合成減少。

3.3 短期夜間低溫條件下秋茄幼苗葉片氮代謝特征

抗寒鍛煉過程中秋茄葉片內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)含量增加，其原因可能有兩方面：一方面是某些高分子蛋白質(zhì)的降解，另一方面可能有抗寒新蛋白質(zhì)的合成，但其原因仍未定論[11]。在本研究中，低溫16 h內(nèi)時秋茄葉片可溶性蛋白質(zhì)、游離氨基酸含量均一直增加，其中前者增加幅度較大，并存在顯著差異，而后者僅在低溫4、16 h存在顯著差異，這與葉片蛋白質(zhì)水解酶(內(nèi)肽酶和羧肽酶)有緊密關(guān)系。因?yàn)閮?nèi)肽酶在組織衰老期間能促進(jìn)蛋白質(zhì)降解，使葉片蛋白質(zhì)降解為小肽，小肽則被外肽酶進(jìn)一步水解為氨基酸[33]。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，當(dāng)短期夜間低溫4 h時，內(nèi)肽酶和羧肽酶活性均顯著增加，結(jié)合可溶性蛋白質(zhì)和游離氨基酸含量變化規(guī)律，說明短期低溫促進(jìn)秋茄葉片蛋白質(zhì)快速降解。當(dāng)?shù)蜏?、12 h時，顯著下降的內(nèi)肽酶活性抑制了蛋白質(zhì)分解為小肽，盡管羧肽酶活性增加了，但仍未能提高秋茄葉片游離氨基酸含量。當(dāng)?shù)蜏?6 h時，內(nèi)肽酶活性仍顯著下降，由蛋白質(zhì)降解為小肽的過程仍受到嚴(yán)重抑制，但羧肽酶活性卻顯著升高，仍能促進(jìn)更多的小肽進(jìn)一步水解為氨基酸，這也表明短期低溫條件下秋茄羧肽酶在蛋白質(zhì)水解過程中起著重要作用。

綜上所述，低溫16 h時光合作用的下降主要是因?yàn)榉菤饪讓?dǎo)度限制引起，這與低溫12 h后葉綠素、類胡蘿卜素合成有關(guān)，同時，短期低溫仍導(dǎo)致秋茄幼苗葉片細(xì)胞膜受損，產(chǎn)生膜脂過氧化傷害。另外，低溫通過影響SS、SPS、內(nèi)肽酶以及羧肽酶活性，秋茄的糖代謝和蛋白質(zhì)水解過程均受到了抑制。

[1] Van Heerden P D R, Krüger G H J. Dark chilling inhibition of photosynthesis and symbiotic nitrogen fixation in soybean during pod filling. Journal of Plant Physiology, 2004, 161(5): 599- 609.

[2] Bertamini M, Muthuchelian K, Rubinigg M, Zorer R, Velasco R, Nedunchezhian N. Low-night temperature increased the photoinhibition of photosynthesis in grapevine (VitisviniferaL. cv. Riesling) leaves. Environmental and Experimental Botany, 2006, 57(1/2): 25- 31.

[3] Li G, Li T, Liu A. Recovery effect of tomato leaves photosynthesis and chloroplast ultrastructure after a short-term low nocturnal temperature. Chinese Journal of Applied Ecology, 2009, 20 (4): 798- 804.

[4] Hu R, Jiang H, Li Y. Research advance on sucrose synthesize enzymes. Northern Horticulture, 2012, (1): 167- 170.

[5] Miao M, Zhang Z, Xu X, Wang K, Cheng H, Cao B. Different mechanisms to obtain higher fruit growth rate in two cold-tolerant cucumber (CucumissativusL.) lines under low night temperature. Scientia Horticulturae, 2009, 119(4): 357- 361.

[6] Khayat E, Zieslin N. Effect of Night Temperature on the Activity of Sucrose Phosphate Synthase, Acid Invertase, and Sucrose Synthase in Source and Sink Tissues ofRosahybridacv Golden Times. Plant Physiol., 1987, 84(2): 447- 449.

[7] Qi H, Jiang Y, Hua L. Responses to short-term low night temperature of sucrose-metabolizing in domesticated tomato and wild relative. Acta Horticulture Sinica, 2012, 39(2): 281- 288.

[8] Wang P, Yin Y, Fu G, Guo Y, Cai R, Liang T, Geng Q, Wu Y, Wang Z. Effect of phosphorus on activities of enzymes of enzymes related to nitrogen metabolism in flag leaves and protein content of wheat grains. Plant Nutrition and Fertilizer Science, 2009, 15(1): 24- 31.

[9] Lu B, Yuan Y, Zhang C, Qu J, Zhou W, Lin Q. Modulation of key enzymes involved in ammonium assimilation and carbon metabolism by low temperature in rice (OryzasativaL.) roots. Plant Science, 2005, 169(2): 295- 302.

[10] Wang Y, Lü D, Qin S, Zhang Y, Ma H, Liu G, Meng Q. Effects of low-temperature on enzymes activities of nitrogen metabolism and free amino acids contents in root ofMalusbaccataBorkh. andMalushupehensisRehd. Seedlings. Acta Horticulture Sinica, 2010, 37(2): 179- 184.

[11] Yang S, Lin P. Cold-resistance ability of two mangrove speciesKandeliacandelandAegicerascorniculatumduring their overwintering period. Chinese Journal of Applied Ecology, 1997, 8 (6): 561- 565.

[12] Chen L Z，Wang W Q，Zhang Y H，Huang L, Zhao C L, Yang S C, Yang Z W, Chen Y C, Xu Hua L, Zhong C R, Su B, Fang B Z, Chen N M, Zeng C Z, Lin G H. Damage to mangroves from extreme cold in early 2008 in southern China. Chinese Journal of Plant Ecology, 2010, 34 (2): 186- 194.

[13] Yong S, Tong C, Zhuang C, Yang W, Li X, Zhang L, Huang J. Effects of cold weather on seedlings of three mangrove specicies planted in the Min River estuary during the 2010 winter. Acta Ecologica, 2011, 31(24): 7542- 7550.

[14] Li H S. Experimental Principle and Technique for Plant Physiology and Biochemistry. Beijing: Higher Education Press, 2000

[15] Tan W, Liu J, Dai T, Jing Q, Cao W, Jiang D. Alterations in photosynthesis and antioxidant enzyme activity in winter wheat subjected to post-anthesis waterlogging. Photosynthetica, 2008, 46 (1): 21- 27.

[16] Du Z, Bramlage W J. Modified thiobarbituric acid assay for measuring lipid oxidation in sugar-rich plant tissue extracts. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1992, 40 (9): 1566- 1570.

[17] Fales FW. The assimilation and degradation of carbohydrates by yeast cells. Journal of Biological Chemistry, 1951, 193 (1): 113- 124.

[18] Zhang Z, Qu W. Plant Physiology Experiment Guide. Beijing: Higher Education Press, 2003

[19] BradfordM M. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the princip le of protein-dye binding. Annual Review of Biochemistry, 1976, 72: 248- 254.

[20] Tang Z. Modern Plant Physiology Experimental Guide. Beijing: Science and Technology, 1999

[21] Wang D, Yu Z, Wang X. Effects of sulfur on p rotein accumulation in kernels of winter wheat. Acta Agronomica Sinica, 2003, 29 (6): 878- 883.

[22] Kao Y, Shih C, Tsai T. Sensitivity to chilling temperatures and distribution differ in the mangrove speciesKandeliacandelandAvicenniamarina. Tree Physiology, 2004, 24(7): 859- 864.

[23] Yang S, Lin P, Li Z, Wang Q. Effect of low night temperature on Photosynthetic properties of mangrove seedling. Journal of Xiamen University (Natural Science), 1999, 38 (4): 617- 622.

[24] Farquhar G D, Sharkey T D. Stomatal conductance and photosynthesis. Annual Review of Plant Physiology，1982，33: 317- 345.

[25] Zhan W, Sha W, Wang M, Shi S, Wen Q. Effects of the variations in precipitation and temperature on photosynthetic parameters and growth ofFraxinusmandshuricaseedlings in Changbai Mountains of Northeast China. Chinese Journal of Applied Ecology, 2012, 23(3):617- 624.

[26] Bertamini M, Muthuchelian K, Rubinigg M, Zorer R, Nedunchezhian N. Low-night temperature (LNT) induced changes of photosynthesis in grapevine (VitisviniferaL.) plants. Plant Physiology and Biochemistry, 2005, 43(7): 693- 699.

[27] Huang M, Guo Z. Responses of antioxidative system to chilling stress in two rice cultivars differing in sensitivity. Biologia Plantarum, 2005, 49 (1): 81- 84.

[28] Maslenkova LT, Zanev Y, Adaptation to salinity as monitored by PSⅡ oxygen evolving reactions in barley thylakoids. Journal of Plant Physiology, 1993, 142(5): 629- 634.

[29] Sairam R K, Rao KV, Srivastava GC. Differential response of wheat genotypes to long term salinity stress in relation to oxdative stress, antioxidant activity and osmolyte concentration. Plant Science, 2002, 163(5): 1037- 1046.

[30] Chen L, Du X, Lu L, Zheng S, Yang S. Synergistic effects of low temperature in winter and ebb tide at night on Sonneratia apetala seedlings growth and key eco-physiological traits．2012, 23(4): 953- 958.

[31] Demmig-Adams B, Winter K, Kruger A, Czygen F C. Zeaxanthin synthesis, energy dissipation and photoprotection of photosystem Ⅱ at chilling temperatures, Plant Physiology, 1989, 90(3): 894- 898.

[32] Liu Y, Li T, Jiao X. Effects of Short-term Sub-low Night temperature treatment and recovery on the photosynthesis and sucrose-metabolizing of tomato leaves. Acta Horticulture Sinica, 2011, 38(4): 683- 691.

[33] Dalling M J, Boland G, Wilson J H. Relation between acid p roteinase activity and redistribution of nitrogen during grain development in wheat. Australian Journal of Plant Physiology, 1976, 3(6): 721- 730.

參考文獻(xiàn)：

[3] 李國強(qiáng)，李天來，劉愛群. 短期夜間低溫后番茄光合作用及葉綠體超微結(jié)構(gòu)的恢復(fù)效應(yīng). 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報，2009，20(4)：798- 804.

[4] 胡瑞芳，姜慧，李玥瑩. 蔗糖代謝相關(guān)酶的研究進(jìn)展. 北方園藝，2012，(1)：167- 170.

[7] 齊紅巖，姜巖巖，華利靜. 短期夜間低溫對栽培番茄和野生番茄果實(shí)蔗糖代謝的影響. 園藝學(xué)報，2012，39(2)：281- 288.

[8] 王平，尹燕桿， 付國占，郭瑩，蔡瑞國，梁太波，耿慶輝，鄔云海，王振林. 施磷對小麥旗葉氮代謝關(guān)鍵酶活性和子粒蛋白質(zhì)含量的影響. 植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報，2009，15(1)：24- 31.

[10] 王英，呂德國，秦嗣軍，張玉龍，馬懷宇，劉國成，孟倩.低溫對山定子和平邑甜茶幼苗. 低溫對山定子和平邑甜茶幼苗根系氮代謝酶及游離氨基酸的影響. 園藝學(xué)報,2010,37(2):179- 184

[11] 楊盛昌，林鵬. 紅樹植物秋茄和桐花樹抗寒力的越冬變化. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報，1997，8(6)：561- 565.

[12] 陳鷺真，王文卿，張宜輝，黃麗，趙春壘，楊盛昌，楊志偉，陳粵超，徐華林，鐘才榮，蘇博，方柏州，陳乃明，曾傳志，林光輝. 2008年南方低溫對我國紅樹植物的破壞作用. 植物生態(tài)學(xué)報，2010, 34 (2): 186- 194.

[13] 雍石泉，仝川，莊晨輝，楊渭平，李旭偉，張林海，黃佳芳．2010 年冬季寒冷天氣對閩江口3 種紅樹植物幼苗的影響． 生態(tài)學(xué)報，2011，31 (24): 7542- 7550．

[14] 李合生. 植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù). 北京：高等教育出版社，2000

[18] 張志良，瞿偉菁．植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)．北京：高等教育出版社，2003

[20] 湯章城. 現(xiàn)代植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指南. 北京：科學(xué)出版社，1999

[21] 王東，于振文，王旭東．硫素對冬小麥籽粒蛋白質(zhì)積累的影響．作物學(xué)報，2003，29(6)： 878- 883

[23] 楊盛昌，林鵬，李振基，王文卿. 夜間低溫對紅樹幼苗光合特性的影響. 廈門大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，1999，38(4)：617- 622.

[25] 戰(zhàn)偉，沙偉，王淼，師帥，問青春. 降水和溫度變化對長白山地區(qū)水曲柳幼苗生長和光合參數(shù)的影響. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報，2012，23(3)：617- 624.

[30] 陳鷺真，杜曉娜，陸鑾眉，鄭仕杰，楊盛昌. 模擬冬季低溫和夜間退潮對無瓣海桑幼苗的協(xié)同作用. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報，2012，23(4)：953- 958.

[32] 劉玉鳳，李天來，焦曉赤. 短期夜間亞低溫及恢復(fù)對番茄光合作用和蔗糖代謝的影響. 園藝學(xué)報，2011，38(4)：683- 691.

Effectsofshort-termdarkchillingonleavescarbonandnitrogenmetabolismandinvolvedactivitiesofenzymesinmangroveKandeliaobovataseedling

ZHENG Chunfang, LIU Weicheng, CHEN Shaobo*, QIU Jianbiao, HUANG Li, PENG Xin, HUANG Xiaolin, WANG Ning

ZhejiangKeyLaboratoryofExploitationandPreservationofCoastalBio-resource,WenzhouOceanResearchInstitute,ZhejiangMaricultureResearchInstitute,Wenzhou,Zhejiang325005,China

The frequency, duration and intensity of extreme cold events have been hypothesized to explain the current latitudinal limits of mangrove distribution. At present,Kandeliaobovatais the major mangrove species for forestation on the southeast coast of China, whose northern distribution boundary transplanted is in Yueqing county (28°25′N). Therefore, the incidence of extreme cold events is likely to be a factor limiting mangrove survival ratio.Kandeliaobovataseedling grown in a controlled-environment chamber equipped were exposed to two different night temperature regimes: (low temperature treatment)-2℃ and (control) 20℃ for 12 h. During the day, temperature were maintained in both treatments at a minimum of 5 ℃ and a maximum of 25 ℃ for 4 h. Our objective was to investigate the possible physiological mechanisms ofKandeliaobovatain responses to the short-term chilling 16 hours.Kandeliaobovataseedling were cultivated in the illuminating incubator to study the effects of short-term dark chilling on photosynthetic characteristic, photosynthetic pigment contents, antioxidation system, cell membrane permeability and involved activities of enzymes in carbon and nitrogen metabolism. The results obtained are as follows: (1) The leaf net photosynthetic rate (Pn), stomatal conductance (Gs) and stomatatal limitation (Ls) ofKandeliaobovatawere significantly decreased at low temperature 16 h, while leaf intercellular CO2concentration was increased. (2)The contents of chlorophyll, carotenoids, and Chl a/Chl b ratio in leaf had no significantly changes at low temperature less than 8 h, whereas leaf Car/Chl ratio was significantly improved. In addition, photosynthetic pigment contents were decreased at low temperature between 12 h and 16 h. (3) The leaf total soluble sugars was increased during low temperature 16 h, while sucrose content, sucrose synthase (SS) and sucrose phosphate synthase (SPS) activities were decreased after low temperature 12 h. (4) The contents of soluble protein and free amino acid and carboxypeptidase activity in leaf were increased during low temperature 16 h, while endopeptidase activity in leaf begun to drop at low temperature 8 h. (5) During low temperature 16 h, the relative conductivity and malondialdehyde (MDA) content in leaf were increased, while activity of POD was decreased, especially in dark. Also, low temperature both 4 h and 16 h treatments suppressed leaf superoxide dismutase (SOD) activity. These results demonstrate that non-stomatal restriction was cause for reducedKandeliaobovataphotosynthesis at low temperature 16 h, which was mainly associated with reduced photosynthetic pigment and depressed antioxidant enzyme activity. Moreover, short-term low night temperature restrained leaf carbon and nitrogen metabolic self-regulation inKandeliaobovataby affecting activities of SS, SPS, endopeptidase and carboxypeptidase.

Kandeliaobovata; short-term dark chilling; photosynthesis; sucrose-metabolizing enzymes; proteolytic enzymes

國家海洋公益性行業(yè)科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目(201005012，200805072)；浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(LQ13C030002)；浙江省近岸水域生物資源開發(fā)與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放資助項(xiàng)目(2010F30003)；浙江省科技廳創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)與人才培養(yǎng)資助項(xiàng)目(2011F20032)；浙江省海洋與漁業(yè)資助項(xiàng)目(高緯度紅樹林生態(tài)恢復(fù)關(guān)鍵技術(shù)應(yīng)用示范)；溫州市科技計劃資助項(xiàng)目(S20110007)

2012- 05- 16;

2012- 10- 26

*通訊作者Corresponding author.E-mail: chenshaobo@hotmail.com

10.5846/stxb201205160730

鄭春芳，劉偉成，陳少波，仇建標(biāo)，黃麗，彭欣，黃曉林，王寧.短期夜間低溫脅迫對秋茄幼苗碳氮代謝及其相關(guān)酶活性的影響.生態(tài)學(xué)報,2013,33(21):6853- 6862.

Zheng C F, Liu W C, Chen S B, Qiu J B, Huang L, Peng X, Huang X L, Wang N.Effects of short-term dark chilling on leaves carbon and nitrogen metabolism and involved activities of enzymes in mangroveKandeliaobovataseedling.Acta Ecologica Sinica,2013,33(21):6853- 6862.