陳智學(xué)，谷 潔，高 華，王小娟，陳 琳，胡 婷

(1. 西北農(nóng)林科技大學(xué)理學(xué)院, 楊凌 712100； 2. 西北農(nóng)林科技大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院, 楊凌 712100)

土霉素對(duì)堆肥過程中酶活性和微生物群落代謝的影響

陳智學(xué)1，谷 潔2,*，高 華2，王小娟2，陳 琳1，胡 婷2

(1. 西北農(nóng)林科技大學(xué)理學(xué)院, 楊凌 712100； 2. 西北農(nóng)林科技大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院, 楊凌 712100)

以豬糞和秸稈為試驗(yàn)材料，研究了土霉素對(duì)堆肥溫度、種子發(fā)芽指數(shù)、C/N、纖維素酶、脲酶、過氧化氫酶以及微生物群落代謝的影響。結(jié)果表明, 0 mg/kg (對(duì)照處理)的堆肥在第2天上升到 50 ℃以上, 維持了 5 d，達(dá)到了無害化處理的要求。35 mg/kg土霉素處理(A1 處理)第4天升到 51.0 ℃，其高溫期維持了 1 d。70 mg/kg 土霉素處理(A2 處理)第3天升到 50 ℃以上，高溫期維持了 2 d。105 mg/kg 土霉素處理(A3 處理)和 140 mg/kg 土霉素處理(A4 處理)的溫度在整個(gè)堆肥期間均未達(dá)到 50 ℃。在堆肥結(jié)束時(shí)各個(gè)處理的種子發(fā)芽指數(shù)均達(dá)到 80% 以上。CK(對(duì)照處理)、A1、A2、A3 和 A4 處理的 C/N 由 34.50 分別降為 16.64、16.07、19.48、18.45 和 19.83。堆肥的第1天，A1、A2、A3 和 A4 處理對(duì)纖維素酶活性的抑制率分別為 60.30%、21.30%、48.81% 和 76.05%，第3天，土霉素對(duì)纖維素酶活性起促進(jìn)作用，在 4—30 d，A3、A4 處理對(duì)纖維素酶活性有抑制作用。在堆肥的前期(1—3 d)，土霉素刺激脲酶活性，隨著堆肥時(shí)間的延長(zhǎng)，土霉素對(duì)脲酶活性由刺激變?yōu)橐种谱饔?，在?8—30天 A3、A4 處理與 CK 相比有著顯著的抑制作用。在堆肥第1天到第18天，土霉素基本上促進(jìn)過氧化氫酶的活性，堆肥 18 d 之后土霉素對(duì)過氧化氫酶起著是抑制作用。用 Biolog (ECO Microplate)方法研究了土霉素對(duì)堆肥過程中微生物群落代謝的影響，結(jié)果表明，在升溫期 CK 處理的平均顏色變化率AWCD (Average Well Color Development)在培養(yǎng) 60 h 之后大于其他處理，高溫期 A2 處理的 AWCD 值最高，在降溫期 CK 的 AWCD 值一直是最高的。對(duì) Shannon 指數(shù)進(jìn)行分析顯示，堆肥的初始階段土霉素降低微生物群落的功能多樣性，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，土霉素增加微生物群落的功能多樣性。對(duì)微生物利用六大類碳源分析表明, 140 mg/kg 的土霉素濃度能夠改變微生物利用碳源的種類。

土霉素；堆肥；酶活性；微生物群落

隨著集約化程度的提高和生產(chǎn)規(guī)模的擴(kuò)大，我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)產(chǎn)生的畜禽糞便己經(jīng)對(duì)自然環(huán)境造成了嚴(yán)重的污染，成為制約集約化養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的主要問題之一[1]?？股鼐哂写偕L(zhǎng)和殺菌作用，被很多國(guó)家廣泛用于畜牧業(yè)，導(dǎo)致大量未被吸收的抗生素在畜禽糞便中殘留[2- 4]。堆肥作為一種集糞便處理和資源再生利用于一體的生物處理方法，有生產(chǎn)成本低、生產(chǎn)過程不對(duì)環(huán)境造成二次污染、產(chǎn)品肥效較長(zhǎng)、改良土壤等優(yōu)點(diǎn)，在國(guó)內(nèi)外受到了廣泛的關(guān)注。

堆肥過程中的物質(zhì)轉(zhuǎn)化主要是在酶參與下進(jìn)行的酶促反應(yīng)，包括有機(jī)物的分解與合成，有機(jī)物的分解過程是水解酶類起催化作用的生物化學(xué)反應(yīng)[5]；土壤中合成新的穩(wěn)定的有機(jī)化合物的過程是氧化還原酶起催化作用的生物化學(xué)反應(yīng)[6]。目前，人們對(duì)畜禽糞便堆腐的研究，主要集中在堆腐條件的控制和一些重金屬對(duì)堆腐過程的影響[7- 10]，沒有對(duì)堆腐過程中抗生素對(duì)酶活性及微生物群落多樣性變化進(jìn)行研究。我國(guó)已有 17 種抗生素、抗氧化劑、激素類藥物用于飼喂畜禽，其中四環(huán)素類最多。四環(huán)素類抗生素主要有 3 種，即土霉素(Oxytetracycline, OTC)、四環(huán)素(Teracycline, TC)和金霉素(Chloroteracyline, CTC)，約占抗生素總量的 57%[11]。張樹清的研究結(jié)果表明，32 個(gè)豬糞樣品中，土霉素、四環(huán)素、金霉素平均含量分別為 9.09、5.22、3.57 mg/kg[12]，其中土霉素的含量在1.05—134.75 mg/kg。本試驗(yàn)通過露天堆肥的方式研究土霉素對(duì)堆肥過程中微生物群落功能多樣性和酶活性的影響，旨在揭示土霉素在堆肥過程中的微生態(tài)效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)用的土霉素購自Sigma 公司，純度為98%。以農(nóng)家養(yǎng)殖廠豬糞、秸稈為堆肥材料，原材料的基本性質(zhì)見表1。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

堆肥試驗(yàn)于 2011 年 11 月 3 日至 2011 年 12 月 4 日在西北農(nóng)林科技大學(xué)資環(huán)學(xué)院堆腐試驗(yàn)場(chǎng)進(jìn)行，堆肥為露天堆肥。把長(zhǎng)約 3—5 cm 的小麥秸稈與豬糞混合，每個(gè)堆體添加豬糞 80 kg，秸稈 43 kg，使每個(gè)堆體的 C/N(碳氮比)為 34.50，加水調(diào)節(jié)含水率至 65%[13]，最后形成直徑約 1.5 m，高約 1m 的圓錐形堆體。實(shí)驗(yàn)設(shè) 5 個(gè)處理，根據(jù)張樹清對(duì) 7 個(gè)省、市、自治區(qū)的規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)豬糞中土霉素的含量的測(cè)定結(jié)果(土霉素的含量在1.05—134.75 mg/kg)[12]，分別添加土霉素的量(占豬糞干重的比例)如下：0 mg/kg (對(duì)照處理CK)、35 mg/kg (A1)、70 mg/kg(A2)、105 mg/kg (A3)、140 mg/kg (A4)。分別于第1、3、5、8、11、18 和 30天在堆體多點(diǎn)采集樣品，混勻，4 ℃冰箱冷藏, 用于堆料酶活性和微生物群落代謝的測(cè)定。

表1 堆肥所用原材料的基本性質(zhì)(烘干樣)

1.3 項(xiàng)目測(cè)定與方法

1.3.1 堆肥過程中溫度的測(cè)定

每天10：00、17：00 測(cè)定堆肥溫度，每個(gè)堆體插入 3 個(gè)溫度計(jì)，以上、下午兩次溫度的平均值作為當(dāng)天堆體的溫度。

1.3.2 種子發(fā)芽指數(shù)的測(cè)定。

樣品與蒸餾水按1 ∶10 比例充分混合，取10 mL 濾液以3 000 r/min 離心10 min，吸取5 mL上清液于鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中，放置10粒上海青種子，用蒸餾水作為對(duì)照，25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)5 d，計(jì)算種子的發(fā)芽率，并用游標(biāo)卡尺測(cè)量種子的根長(zhǎng)。根據(jù)下列公式，計(jì)算種子的發(fā)芽指數(shù)(GI)：

1.3.3 堆肥過程中酶活性的測(cè)定

酶活性測(cè)定參照關(guān)松蔭的方法[14]。測(cè)定葡萄糖生成量以表征纖維素酶活性，單位為 mg葡萄糖·g-1·d-1表示。測(cè)定氨的生成量以表征脲酶活性，單位用 mg NH3-N·g-1·d-1表示。測(cè)定高錳酸鉀的消耗量以表征過氧化氫酶活性，單位用0.001mol/L KMnO4·g-1·20min-1) 表示。

1.3.4 堆肥不同時(shí)期微生物群落功能多樣性測(cè)定

本試驗(yàn)微生物群落功能多樣性采用 Biolog 生態(tài)測(cè)試板測(cè)定。具體操作步驟如下：分別從第1天(升溫期)、第5天(高溫期)、第11天(降溫期)的各個(gè)處理堆肥中部多點(diǎn)取樣，混合后取 5 g 堆肥樣品(干重計(jì)算)，加入裝有 45 mL 無菌生理鹽水的三角瓶中，160 r/min振蕩1 h，靜置片刻后取上清液，將其用 0.85% 氯化鈉無菌生理鹽水稀釋至 10-3倍。在超凈工作臺(tái)上，接種微生物懸浮液于 ECO 微平板中，每孔 150 μL。將接種的 ECO 板裝入聚乙烯盒中置于 28℃ 暗箱中培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng) 240 h，每 12 h 在 ELISA(Enzyme-linked Immun-osorbent Assay，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定)微平板讀數(shù)器上讀數(shù)一次以采集數(shù)據(jù)[15]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

平均每孔顏色變化率(AWCD)的計(jì)算公式為：AWCD=∑(Ci-R)/31,式中，Ci為各反應(yīng)孔在590 nm下的光密度值；R為ECO板對(duì)照孔A1的光密度值；Ci-R小于零的孔，計(jì)算中記為零，即:Ci-R≥ 0。選取96 h的ECO板的讀數(shù)結(jié)果，對(duì)其進(jìn)行微生物群落多樣性分析，微生物群落 Shannon 指數(shù)(H)：H=-∑Pi×lnPi，式中Pi=(Ci-R)/∑(Ci-R)，表示有碳源的孔與對(duì)照孔 A1 的光密度值之差與整板總差的比值。

數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析采用 Excel(V 2003)、SPSS(16.0)軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 堆肥過程中溫度的變化

溫度的高低是決定堆肥成敗的關(guān)鍵[16]，根據(jù)《農(nóng)業(yè)廢棄物無害化處理標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定：在 50—55 ℃ 以上持續(xù) 5—7 d(或 55 ℃條件下保持 3 d 以上)可殺滅病原微生物，實(shí)現(xiàn)無害化。由表 2 可見，CK 處理堆肥在第2天上升到 50.7 ℃，第4天到達(dá)最高溫度 52.7 ℃，高溫期維持了5 d，達(dá)到了無害化處理的要求。A1 處理第4天升到 51.0 ℃且僅維持了1d。A2 處理第3天升到 50 ℃以上，最高溫度 52.0 ℃出現(xiàn)在第4天，高溫僅維持2d。A3 處理的溫度在整個(gè)堆肥期間均未達(dá)到 50 ℃，最高溫度 47.2 ℃ 出現(xiàn)在第4天。A4 處理的溫度沒有一天達(dá)到 50 ℃。第5天之后，各個(gè)處理的溫度差異不大，這可能由于在前期土霉素殺死某些微生物，呈現(xiàn)出抑制效應(yīng)[17]，隨著時(shí)間的延續(xù)，環(huán)境會(huì)產(chǎn)生抗性種群[18]，增加堆料中微生物的代謝活性，導(dǎo)致溫度恢復(fù)到正常水平。

表2 堆肥過程中溫度的變化

數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD),n=6；同一列數(shù)據(jù)中不同字母表示處理間差異顯著(Plt;0.05)；-: 未能達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)

2.2 堆肥腐熟指標(biāo)

種子發(fā)芽指數(shù)(GI)被認(rèn)為是最敏感、最可靠的堆肥腐熟度評(píng)價(jià)指標(biāo)。一般認(rèn)為，當(dāng)GI大于 80%時(shí)，就可以判斷堆肥腐熟[19]。由表 3 可見，在堆肥結(jié)束時(shí)，A3和A4 處理的種子發(fā)芽指數(shù)分別是 78.48% 和70.68%，表明土霉素的濃度過高會(huì)對(duì)堆肥的品質(zhì)造成較大的影響。CK 的 pH值最高，為8.78，A4 處理的 pH 值最低，為 8.56。 CK、A1、A2、A3和A4 處理的 C/N 由初始的 34.50 分別降為 16.64、16.07、19.48、18.45和19.83，說明經(jīng)過堆肥化處理后，使得C/N 下降。

表3 堆肥腐熟指標(biāo)

數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)，n=3；同一列數(shù)據(jù)中不同字母表示處理間差異顯著(Plt;0.05)

2.3 堆肥期間不同土霉素濃度對(duì)酶活性的影響

堆肥過程中物質(zhì)轉(zhuǎn)化是在酶參與下進(jìn)行的酶促反應(yīng)過程[20]。土霉素通過影響環(huán)境中微生物的種類與數(shù)量，進(jìn)而對(duì)酶的分泌造成影響。

2.3.1 堆肥過程纖維素酶活性的變化

纖維素酶參與碳的循環(huán)[21]。從表 4 看出，纖維素酶活性隨時(shí)間呈雙峰曲線，在第1天，添加土霉素處理纖維素酶活性顯著低于 CK(Plt;0.05)，A1、A2、A3 和 A4 處理對(duì)纖維素酶活性的抑制率分別為 60.30%、21.30%、48.81% 和 76.05%。隨著時(shí)間的延續(xù)，纖維素酶活性迅速增加，導(dǎo)致 A1 處理與 CK 的纖維素酶活性在第3天和第5天差異不顯著?？赡艿脑蚴浅跗诘蜐舛鹊耐撩顾貙?duì)微生物分泌纖維素酶的活性有抑制作用，之后由于土霉素不斷的降解[22]，導(dǎo)致對(duì)纖維素酶的影響不大。對(duì)于 A2 和 A3 處理而言，土霉素對(duì)纖維素酶活性的影響比較復(fù)雜，可能由于隨著堆肥時(shí)間的延長(zhǎng)，土霉素抑制微生物的活性與作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)刺激一些抗性微生物的活性共同作用[18]。A4 處理的纖維素酶活性在第3天之后處于一個(gè)低的水平，可見經(jīng)過前期土霉素的毒性作用，140 mg/kg 土霉素處理對(duì)能夠分泌纖維素酶的微生物有著抑制作用。

表4 堆肥過程中纖維素酶活性變化/(mg葡萄糖·g-1·d-1)

數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)，n=3；同一列數(shù)據(jù)中不同字母表示處理間差異顯著(Plt;0.05)

2.3.2 堆肥過程脲酶活性的變化

脲酶與氮代謝密切相關(guān)[23]。由表 5 可見，脲酶活性隨時(shí)間也呈雙峰曲線變化，但 A3 和A4 處理變化不明顯。原因可能是堆肥初期原料中有機(jī)質(zhì)含量高、營(yíng)養(yǎng)豐富，促進(jìn)了耗氧微生物生長(zhǎng)和酶的合成，使酶活逐漸增至最大值[24]。由于高溫的持續(xù)作用，微生物的數(shù)量和活性受到抑制，酶活性下降。谷潔研究發(fā)現(xiàn)在一定的溫度期間堆料中脲酶活性變化與溫度變化具有負(fù)相關(guān)關(guān)系[25]，隨著溫度的下降，堆料里的微生物種群又開始活躍起來，在堆肥的第18天又達(dá)到一個(gè)高峰。經(jīng)過有機(jī)物質(zhì)的快速降解階段(0—25 d)[26], 能量不足造成酶活性逐漸降低。

從表中還可以看出，在 1—3 d 添加土霉素處理脲酶活性比 CK 高，這與姚志鵬結(jié)果一致[27]。盡管土霉素對(duì)一些具有分泌脲酶功能的微生物有毒害作用，但即使這樣，由于土霉素具有酰胺鍵結(jié)構(gòu)，而脲酶以酰胺鍵作為底物，根據(jù)底物誘導(dǎo)原理，導(dǎo)致在堆肥前期土霉素對(duì)脲酶活性的正效應(yīng)大于負(fù)效應(yīng)。在堆肥的第5天，所有處理脲酶活性均達(dá)到最高值，處理之間差異不顯著。隨著時(shí)間的再延續(xù)，高濃度和極高濃度的土霉素對(duì)脲酶活性的抑制效應(yīng)越來越明顯，從第18天和第30天數(shù)據(jù)來看，A3 和 A4 處理脲酶活性與 CK 相比已下降至顯著水平。而低濃度和中濃度土霉素未對(duì)堆料中脲酶活性產(chǎn)生顯著的影響(Pgt;0.05)。這是由于堆肥后期，超過一定濃度的土霉素的積累毒害作用，導(dǎo)致微生物的密度降低，進(jìn)而分泌脲酶的微生物比 CK 要少。

表5 堆肥過程中脲酶活性變化/(mg NH3-N·g-1·d-1)

數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)，n=3; 同一列數(shù)據(jù)中不同字母表示處理間差異顯著(Plt;0.05)

2.3.3 堆肥過程過氧化氫酶活性的變化

過氧化氫酶的活性與有機(jī)質(zhì)的含量有關(guān)，與微生物數(shù)量也有關(guān)[13]。由表 6 可見，在第1天土霉素對(duì)過氧化氫酶活性有激活作用，A1、A2、A3 處理與 CK 差異顯著(Plt;0.05)，原因可能是一些微生物針對(duì)一定濃度的土霉素毒害作用的脅迫，需要分泌更多的過氧化氫酶[28]，極高濃度土霉素的殺菌作用對(duì)過氧化氫酶活性產(chǎn)生的負(fù)效應(yīng)與土霉素的脅迫產(chǎn)生的正效應(yīng)相互作用造成 A4 處理與 CK 差異不顯著。隨著堆肥時(shí)間的延續(xù)，土霉素基本上是激活過氧化氫酶。在堆肥后期 CK 過氧化氫酶活性為 75.00 mL 0.001mol/L KMnO4·g-1·20min-1，顯著高于其它處理(Plt;0.05)，是由于堆料中的微生物對(duì)藥物適應(yīng)能力增強(qiáng)，土霉素的毒害作用減弱，同時(shí)土霉素的降解作用[22]，導(dǎo)致分泌的過氧化氫酶減少[28]。

表6 堆肥過程中過氧化氫酶的變化/(mL 0.001mol/L KMnO4·g-1·20min-1)

數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)，n=3; 同一列數(shù)據(jù)中不同字母表示處理間差異顯著(Plt;0.05)

2.4 堆肥期間土霉素對(duì)微生物群落功能多樣性的影響

2.4.1 ELISA 平均顏色變化率(AWCD)

AWCD 反映微生物對(duì)碳源的利用率，AWCD 值越大，表明堆料中微生物的活性越高，密度越大[29]。由圖 1 可見，在升溫期，CK 的 AWCD 值在培養(yǎng) 60 h后大于其他處理，表明升溫期土霉素能夠降低微生物活性。

圖1 不同時(shí)期不同處理平均顏色變化率AWCD隨培養(yǎng)時(shí)間的變化Fig.1 AWCD changes with incubation time in different treatments during different periods

在高溫期，A2 處理的 AWCD 值在整個(gè)培養(yǎng)過程高于其它的處理，可能是隨著時(shí)間的增加，環(huán)境會(huì)產(chǎn)生抗性種群[18]，對(duì) AWCD 值產(chǎn)生正的效應(yīng)，同時(shí)土霉素的毒害作用對(duì) AWCD 值產(chǎn)生負(fù)的效應(yīng)[17]，兩者相互作用使得在土霉素濃度占豬糞的比例為 70 mg/kg 時(shí)堆料的微生物活性最高。在降溫期，CK 的 AWCD 值始終是最高的，在 AWCD 值趨于穩(wěn)定之后(108 h 之后)，土霉素的濃度越高，AWCD 值越低，表明在堆肥的后期，抗性微生物的大量死亡，造成微生物的密度較低。

2.4.2 微生物群落多樣性指數(shù)分析

Shannon 多樣性指數(shù)表示在顏色變化率一致的情況下，整個(gè)堆料微生物群落利用碳源類型的多與少，即功能多樣性[30]，Shannon 多樣性指數(shù)越大，表明該堆料微生物系統(tǒng)的功能多樣性越高。本試驗(yàn)采用 Biolog 微平板培養(yǎng) 96 h 的數(shù)據(jù)來進(jìn)行微生物群落功能多樣性分析。

在表 7 中，在升溫期 CK 的 Shannon 指數(shù)最高，和 A2、A3 和 A4 處理差異顯著(Plt;0.05)；在高溫期 A2 處理的 Shannon 指數(shù)最高，各個(gè)處理間的 Shannon 指數(shù)差異不顯著(Pgt;0.05)；在降溫期 A4 處理的 Shannon 指數(shù)最高，CK 的 Shannon 指數(shù)是最低的，A4 與 CK 之間的差異顯著(Plt;0.05)?？梢娫诙逊实某跏茧A段，堆料中土霉素含量為高濃度或極高濃度時(shí)能夠顯著降低微生物群落的功能多樣性。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，土霉素能夠增加堆肥中微生物群落的功能多樣性。原因可能是在堆肥前期，土霉素能夠殺死一些微生物，微生物群落功能多樣性降低。隨著堆肥時(shí)間的延長(zhǎng)抗性微生物大量出現(xiàn)，堆料中的微生物群落的功能多樣性增高。

表7 不同土霉素處理堆料微生物群落功能多樣性指數(shù)

數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)，n=3; 同一行數(shù)據(jù)中不同字母表示處理間差異顯著(Plt;0.05)

2.4.3 堆肥微生物對(duì)六大類碳源的利用

堆料中微生物對(duì)不同碳源的利用情況反映了土壤微生物的代謝功能類群。從表 8 可以看出，在堆肥的3個(gè)期間，微生物對(duì)糖類、氨基酸類、羧酸類有著比較高的利用率，是因?yàn)檫@ 3 類碳源是微生物代謝的基本物質(zhì)，能夠被大部分的微生物所利用。在升溫期，A2、A3 和 A4 處理中的微生物對(duì)六大類碳源的利用與 CK 相比差異顯著(Plt;0.05)，表明在升溫期添加的土霉素濃度超過 35 mg/kg 以上時(shí)，堆料中微生物無論是基礎(chǔ)代謝還是次生代謝都受到了顯著的抑制。在高溫期，A4 處理中的微生物對(duì)糖類的利用相比于其他處理處于一個(gè)比較低的水平，可能是因?yàn)檫^高的土霉素濃度對(duì)微生物的基礎(chǔ)代謝產(chǎn)生了抑制作用。在降溫期，添加土霉素處理與 CK 對(duì)氨基酸和羧酸類的利用差異達(dá)到顯著水平(Plt;0.05)，A2 處理對(duì)氨基酸的利用是最低的，A3 處理對(duì)羧酸類利用是最低的，反映出土霉素添加對(duì)堆料中微生物利用碳源的能力產(chǎn)生了顯著的影響。從整個(gè)堆肥過程來看，A1 處理只在高溫期對(duì)多聚化合物，降溫期對(duì)氨基酸和羧酸類利用與 CK 差異顯著(Plt;0.05)，表明低濃度的土霉素對(duì)微生物代謝能力的影響不大；A2 和 A3 處理在高溫期對(duì)六大類碳源的利用與 CK 相比差異達(dá)到顯著水平，隨著堆肥時(shí)間的延長(zhǎng)，A2 和 A3 處理與 CK 對(duì)碳源利用基本沒有顯著的差異。在整個(gè)堆肥期間，A4 處理堆料中微生物對(duì)六大類碳源的利用一直處于一個(gè)較低的水平，表明極高濃度的土霉素處理對(duì)堆料中的微生物利用碳源的能力產(chǎn)生顯著的抑制作用。

表8 不同時(shí)期不同土霉素處理堆料微生物對(duì) 6 類碳源的利用/AWCD

數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)，n=3; 同一列數(shù)據(jù)中不同字母表示處理間差異顯著(Plt;0.05)

3 討論

堆肥化是在一系列酶的作用下進(jìn)行的，堆肥進(jìn)程中的酶活性受到微生物的種類、溫度、pH值等環(huán)境因素的影響[31]。王麗平等人[32]指出土霉素污染對(duì)土壤生物化學(xué)性質(zhì)的影響主要發(fā)生在土霉素進(jìn)入土壤的初期，隨著時(shí)間的增加，影響逐漸減弱和消失。本文研究土霉素對(duì)堆肥溫度的影響表明土霉素能夠?qū)Χ逊实臏囟仍斐梢欢ㄓ绊懀@可能是在堆肥前期土霉素的毒害作用造成微生物大量死亡，整體代謝活性偏低的結(jié)果。Boles[33]等研究發(fā)現(xiàn)土壤中 1 mg/kg的四環(huán)素可顯著抑制土壤脫氫酶和磷酸酶的活性。姚志鵬[27]采用室內(nèi)培養(yǎng)試驗(yàn)研究了土霉素對(duì)土壤過氧化氫酶、磷酸酶、脲酶、蔗糖酶和脫氫酶活性的影響，表明在培養(yǎng)第1天，100 mg/kg 土霉素處理對(duì)脲酶具有顯著的刺激作用，以后土霉素對(duì)脲酶活性影響不明顯，而對(duì)土壤過氧化氫酶、磷酸酶、蔗糖酶和脫氫酶主要體現(xiàn)抑制作用。本文的酶活性研究結(jié)果表明，140 mg/kg 土霉素濃度處理能夠?qū)w維素酶活性產(chǎn)生抑制作用；對(duì)脲酶的影響是在堆肥初期(1—3 d) 起刺激作用，堆肥后期(18 d 之后)起抑制作用；在堆肥的 1—18 d 對(duì)過氧化氫酶活性基本上起促進(jìn)作用，堆肥后期，抑制過氧化氫酶活性。本文的酶活性研究結(jié)果與上述作者的研究結(jié)果有不一致的地方，主要體現(xiàn)在土霉素對(duì)脲酶活性的影響，本試驗(yàn)研究結(jié)果是，在后期土霉素的濃度達(dá)到105 mg/kg 時(shí)對(duì)脲酶活性起著顯著的抑制作用，而前人研究結(jié)果是后期土霉素濃度的高低對(duì)脲酶活性不會(huì)產(chǎn)生顯著影響?？赡苁且?yàn)楸敬卧囼?yàn)是在堆肥環(huán)境中進(jìn)行的，溫度波動(dòng)較大，導(dǎo)致微生物的種群和數(shù)量變化較大，同時(shí)微生物分泌的胞外酶的量受到堆肥溫度的影響較大。

土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成部分。劉鋒[17]等人研究了抗生素對(duì)土壤微生物呼吸的影響，結(jié)果表明四環(huán)素對(duì)土壤呼吸影響不大，Dijck[34]等研究發(fā)現(xiàn)飼料添加劑中的抗生素對(duì)土壤和水環(huán)境中典型微生物的生長(zhǎng)有明顯的影響。Biolog 微平板法廣泛的被用于環(huán)境微生物群落方面的研究[35]，通過測(cè)定Biolog 微平板中的吸光值表明土霉素在整個(gè)堆肥期間主要對(duì)堆料中微生物的活性起著抑制作用，說明在整個(gè)堆肥期間其毒害作用是一直存在的。而對(duì)微生物群落的功能多樣性的影響主要體現(xiàn)在添加高濃度和極高濃度土霉素的堆料中，具體表現(xiàn)是隨著堆肥時(shí)間的延續(xù)，在超過一定濃度土霉素的脅迫作用下，抗性物種大量產(chǎn)生，堆肥中微生物群落的功能多樣性增加，由此可見，土霉素對(duì)微生物的種類和數(shù)量能夠產(chǎn)生影響，并進(jìn)而影響微生物的代謝活性和群落功能多樣性，這與前人的研究結(jié)論一致。

4 結(jié)論

(1)土霉素能夠?qū)Χ逊实臏囟仍斐梢欢ㄓ绊懀@種影響主要體現(xiàn)在高溫期的維持時(shí)間，一般而言土霉素的濃度越高，對(duì)溫度的影響越大。

(2)土霉素添加濃度達(dá)到105 mg/kg時(shí)，能夠?qū)Χ逊实姆N子發(fā)芽指數(shù)造成顯著的影響。

(3)土霉素的濃度越高對(duì)堆料中酶活性的影響越大，通過3種酶活性活性變化趨勢(shì)分析，在堆肥開始階段，土霉素一般能夠激發(fā)酶的活性，但隨著時(shí)間延長(zhǎng)，土霉素的毒性作用開始顯現(xiàn)出來，對(duì)酶活性的影響逐漸由正效應(yīng)變?yōu)樨?fù)效應(yīng)。

(4)土霉素對(duì)微生物群落代謝的影響體現(xiàn)在：超過一定濃度的土霉素(大于105 mg/kg)對(duì)微生物的群落代謝產(chǎn)生顯著的影響。

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EffectofOxytetraeyeline(OTC)ontheactivitiesofenzymeandmicrobialcommunitymetabolicprofilesincomposting

CHEN Zhixue1, GU Jie2,*, GAO Hua2, WANG Xiaojuan2, CHEN Lin1, HU Ting2

1CollegeofSciences,NorthwestAgricultureandForestryUniversity,Yangling712100,China2CollegeofNaturalResourcesandEnvironment,NorthwestAgricultureandForestryUniversity,Yangling712100,China

An outdoor experiment was conducted to study the effect of oxytetraeyeline addition on composting temperature, seed germination index, ratio of carbon to nitrogen, cellulose, urease, catalase and microbial community metabolism during composting of pig manure mixed with wheat straw. The results showed that composting temperature was reached to 50 ℃ in the second day of composting and lasted for 5 days on treatment without addition of oxytetraeyeline (Control check,CK), which could meet the need of the requirement of harmlessness. The composting temperature was above 51.0 ℃ in the fourth day of composting with addition of 35 mg/kg oxytetracycline (A1 treatment), and the high temperature period maintained for 1 day. The temperature was above 50 ℃ in the third day of composting where 70 mg/kg oxytetracycline was added (A2 treatment), and the high temperature period only hold on for 2 days. The temperature could not reach to 50 ℃ over the whole time of composting on both A3 and A4 treatments where 105 mg/kg and 140 mg/kg of oxytetracycline were spiked respectively. The germination indices (GI) of seeds, which contained in the compost materials, were higher than 80% for all treatments at the end of the composting. The C/N ratios for all treatments were decreased from an initial value of 34.50 to 16.64, 16.07, 19.48, 18.45 and 19.83, respectively, when composting completed. Activities of cellulose on treatments those receiving oxytetracycline were inhibited by 60.30%, 21.30%, 48.81% and 76.05%, respectively, over CK treatment in the first day of the composting, and they were increased in the third day. Nevertheless, activities of cellulase were inhibited under A3 and A4 treatments compared with CK from day 4 to day 30. The activity of urease was increased by addition of oxytetracycline in the first 3 days, since then on, it was decreased. The higher concentrations of oxytetracycline (A3 and A4) had a significant inhibitory effect on activity of urease from day 18 to day 30. The catalase activity was enhanced generally by the addition of oxytetraeyeline from day 1 to day 18 compared to CK, from then on it was decreased over CK. The effect of oxytetracycline addition on microbial community metabolic profiles during composting was assayed with Biolog (ECO Microplate) method. The results showed that AWCD (Average Well Color Development) values of CK treatment were the highest after 60 h incubation during temperature raising period of the compost. The highest AWCD values were observed on A2 treatment during the high temperature period. AWCD values under CK were greater than other treatments over cooling period. Shannon index results suggested that the oxytetracycline addition could reduce the functional diversity of microbial communities in the initial stage of the composting, in contrast, it could increase the functional diversity of microbial communities at other stages of composting. The carbon source utilization data showed that the addition of 140 mg/kg of oxytetracycline could significantly change the types of carbon sources used by microorganisms.

oxytetraeyeline; composting; enzymatic activities; microbial community

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(40871119，41171203)；農(nóng)業(yè)部948資助項(xiàng)目(2010-Z20)

2012- 07- 09;

2013- 02- 27

*通訊作者Corresponding author.E-mail: gujoyer@sina.com

10.5846/stxb201207090961

陳智學(xué)，谷潔，高華，王小娟，陳琳，胡婷.土霉素對(duì)堆肥過程中酶活性和微生物群落代謝的影響.生態(tài)學(xué)報(bào),2013,33(21):6957- 6966.

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