朱家林，賀 娟，牛建群，張青文，劉小俠

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)昆蟲學(xué)系， 北京 100193)

風(fēng)向因素對(duì)轉(zhuǎn)基因抗蟲棉花基因漂移效率的影響

朱家林，賀 娟，牛建群，張青文，劉小俠*

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)昆蟲學(xué)系， 北京 100193)

在轉(zhuǎn)基因作物獲準(zhǔn)進(jìn)行環(huán)境釋放并實(shí)行大面積商品化推廣的同時(shí)，基因漂移所引起的生態(tài)環(huán)境安全問題不容忽視。以含有雙價(jià)抗蟲基因(Bt/CpTI)的轉(zhuǎn)基因棉花SGK321為花粉供體材料，以常規(guī)非轉(zhuǎn)基因棉花品種石遠(yuǎn)321、中棉35、吉扎1號(hào)為花粉受體材料，在溫室中人工創(chuàng)造定向風(fēng)和非定向風(fēng)條件，應(yīng)用PCR與蛋白檢測(cè)相結(jié)合的方法，檢測(cè)外源基因發(fā)生基因漂移的效率。結(jié)果表明：隨著與轉(zhuǎn)基因棉花SGK321距離的增加，外源基因轉(zhuǎn)移至非轉(zhuǎn)基因棉花的基因漂移頻率呈現(xiàn)波動(dòng)性變化。在定向風(fēng)處理中，基因漂移頻率在距離轉(zhuǎn)基因棉花6.4m處達(dá)到峰值33.33%，在測(cè)定范圍內(nèi)基因漂移最遠(yuǎn)距離為25.6m；而在非定向風(fēng)處理中，基因漂移頻率在距離轉(zhuǎn)基因棉花12.8m處達(dá)到峰值36.67%，在測(cè)定范圍內(nèi)基因漂移最遠(yuǎn)距離為36m。非定向風(fēng)可顯著提高轉(zhuǎn)移至海島棉吉扎1號(hào)的基因漂移頻率。外源基因從SGK321轉(zhuǎn)移至其非轉(zhuǎn)基因親本石遠(yuǎn)321的基因漂移頻率顯著高于轉(zhuǎn)移至陸地棉中棉35和海島棉吉扎1號(hào)的漂移頻率。為轉(zhuǎn)基因棉花的生態(tài)安全性分析提供一定的理論參考價(jià)值。

轉(zhuǎn)基因棉花；Bt基因；基因逃逸；定性PCR；生物安全性

轉(zhuǎn)基因生物技術(shù)的迅速發(fā)展和轉(zhuǎn)基因作物的不斷培育推廣，為全球特別是第三世界國(guó)家的糧食保障和經(jīng)濟(jì)發(fā)展帶來了新的機(jī)遇[1]。但是，轉(zhuǎn)基因作物的環(huán)境釋放和商品化生產(chǎn)同時(shí)引起了全世界對(duì)其潛在的環(huán)境生物安全問題的極大關(guān)注和爭(zhēng)議[2- 3]，如外源基因向非轉(zhuǎn)基因植物逃逸的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)[4- 7]、轉(zhuǎn)基因作物長(zhǎng)期種植導(dǎo)致靶標(biāo)生物的抗性進(jìn)化[8- 11]、以及轉(zhuǎn)基因作物對(duì)非靶標(biāo)生物[12- 13]、土壤生物群落[13- 15]、農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)及系統(tǒng)外生物多樣性[16- 17]、轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品食品安全性[18]的潛在影響等。

在轉(zhuǎn)基因作物商品化推廣的過程中，基因漂移是引起生態(tài)環(huán)境安全問題的最主要風(fēng)險(xiǎn)?；蚱?，又稱為基因流(gene flow)，是指遺傳物質(zhì)(一個(gè)或多個(gè)基因)從某一個(gè)生物群體(或居群)轉(zhuǎn)移到另一個(gè)生物群體(或居群)的過程[19- 21]，是生物進(jìn)化的一個(gè)重要過程和非常普遍的自然現(xiàn)象。在植物中，基因漂移的途徑大致分為自然雜交和基因水平轉(zhuǎn)移兩種[21- 22]。花粉介導(dǎo)，作為自然雜交的主要途徑，會(huì)引起不同的植物個(gè)體之間發(fā)生雜交和滲入，從而導(dǎo)致一系列的生態(tài)學(xué)和進(jìn)化生物學(xué)反應(yīng)。由于通過花粉介導(dǎo)的基因漂移有其規(guī)律性可循，其研究成果既具有重要的理論意義，又具有指導(dǎo)生產(chǎn)實(shí)踐的應(yīng)用價(jià)值，因而是植物基因漂移研究中最受關(guān)注的焦點(diǎn)[23- 26]。

棉花是常異花授粉，花朵較大，易造成外媒傳粉的發(fā)生。雖然棉花花粉自身的傳播距離十分有限[27]，但是如果借助昆蟲和風(fēng)力的傳播就可使漂移距離明顯提高。目前關(guān)于轉(zhuǎn)基因棉花基因漂移的研究主要集中在棉花品種間的異花傳粉的雜交親和性[28- 31]、自然條件下基因漂移的可能性和空間范圍[29,32]、昆蟲傳粉對(duì)基因漂移的影響[31- 32]等方面。在我國(guó)，除新疆地區(qū)外，棉花種植區(qū)多屬于季風(fēng)氣候區(qū)[33]。轉(zhuǎn)基因棉花體內(nèi)的外源基因在風(fēng)力條件下向周圍漂移的距離和頻率以及是否受到風(fēng)向的影響引起我們的關(guān)注。明確這些問題，充分利用氣候條件，從而有效地設(shè)置隔離帶，減少甚至杜絕基因漂移的發(fā)生。目前有關(guān)這方面的報(bào)道并不多見。因此，為初步確定風(fēng)向和基因漂移的關(guān)系，本研究通過設(shè)置定向風(fēng)和非定向風(fēng)不同處理，對(duì)溫室內(nèi)轉(zhuǎn)基因棉花基因漂移效率進(jìn)行分子生物學(xué)檢測(cè)，從而有效評(píng)估轉(zhuǎn)基因抗蟲棉花環(huán)境釋放的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)性。

1 材料與方法

1.1 供試材料

花粉供體材料為轉(zhuǎn)基因抗蟲棉花SGK321，SGK321具有人工合成的GFMCryⅠA(C)和經(jīng)過修飾的CpTI的高效雙價(jià)殺蟲基因?；ǚ凼荏w材料為SGK321的非轉(zhuǎn)基因親本陸地棉石遠(yuǎn)321和陸地栽培種中棉35。鑒于海島棉與陸地棉可以雜交，故本試驗(yàn)常規(guī)棉品種選用了世界栽培種海島棉吉扎1號(hào)。以上材料均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2010年在北京市中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)上莊試驗(yàn)基地(40°08′22.92″N, 116°12′16.98″E)的溫室(60m×8m)內(nèi)進(jìn)行。試驗(yàn)分別在兩個(gè)溫室內(nèi)進(jìn)行，見圖1。溫室1設(shè)置A、C處理區(qū)，溫室2設(shè)置B、C處理區(qū)，A為定向風(fēng)處理區(qū)，B為非定向風(fēng)處理區(qū)，C為對(duì)照處理區(qū)，均自北向南依次種植非轉(zhuǎn)基因品種中棉35、石遠(yuǎn)321、吉扎1號(hào)。不同常規(guī)棉品種種植區(qū)域之間用透明薄膜隔開，以防止非轉(zhuǎn)基因棉花之間發(fā)生傳粉。轉(zhuǎn)基因棉花SGK321分別種植于兩個(gè)溫室的中部，種植面積為32m2。株距30cm，行距80cm。栽培方法和田間管理均按常規(guī)棉花生產(chǎn)方式進(jìn)行。

在SGK321種植區(qū)各設(shè)置了3臺(tái)落地電風(fēng)扇(FS40-8A2型，廣東美的環(huán)境電器制造公司)，扇葉5片，其直徑約為50cm，高度約為2m，面向A、B處理區(qū)用于鼓風(fēng)，以使轉(zhuǎn)基因棉花花粉充分?jǐn)U散。A、B處理區(qū)在每個(gè)品種分布區(qū)的上方分別設(shè)置了8臺(tái)風(fēng)程約為5m的電風(fēng)扇(FB40- 1205型，上海華生電器有限公司)，扇葉3片，其直徑約為50cm。電風(fēng)扇設(shè)置于距地面垂直高度2m的欄桿處，水平傾角約為25°，每隔4.5m設(shè)置1臺(tái)，以使處理區(qū)內(nèi)均勻持久受風(fēng)。由于棉花僅白天開花，電風(fēng)扇工作時(shí)間設(shè)置為每天6:00—21:00。A處理為定向風(fēng)處理，風(fēng)向垂直于棉花栽種行的方向，自西向東，保持恒定不變；B處理為非定向風(fēng)處理，風(fēng)向以棉花栽種行的垂直方向?yàn)橹行?，左右?0°勻速變化；C處理為對(duì)照處理，僅作種植，不設(shè)人工風(fēng)力條件。

風(fēng)速測(cè)定使用熱球微風(fēng)儀(ZRQF F303型，北京檢測(cè)儀器有限公司)，在A、B、C三個(gè)處理區(qū)內(nèi)，每隔4.5m為一個(gè)測(cè)量點(diǎn)，水平測(cè)定處理區(qū)的風(fēng)速數(shù)值。為了避免誤差，于當(dāng)天的上午、下午各測(cè)量?jī)纱?，記錄?shù)值并分析匯總測(cè)定結(jié)果。

圖1 溫室各處理的種植布局Fig.1 Field design

1.3 研究方法

1.3.1 非轉(zhuǎn)基因棉花F1代種子采集處理

棉花吐絮后，對(duì)非轉(zhuǎn)基因棉花F1代種子進(jìn)行采集。各處理以與轉(zhuǎn)基因棉田交界處記為0m，A、B處理在距離轉(zhuǎn)基因棉田0.8、1.6、3.2、6.4、12.8、19.2、25.6、36m處進(jìn)行取樣；C處理在距離轉(zhuǎn)基因棉田0.8、1.6、3.2、6.4、12.8、19.2m處進(jìn)行取樣。有研究表明轉(zhuǎn)基因棉花的異交率與所采種子在其植株上的位置基本不存在相關(guān)性[29]，因此，每個(gè)取樣點(diǎn)分別自常規(guī)棉品種的上、中、下部各摘取棉桃，作為3次重復(fù)，分別置于低溫干燥環(huán)境下保存。待軋花脫絨后，采用土培法(蛭石∶草炭=3∶1)室內(nèi)種植，每個(gè)樣點(diǎn)每個(gè)品種隨機(jī)選擇F1代棉苗30株，用于棉葉總DNA提取，取樣共計(jì)2520株棉苗。

1.3.2 PCR分析

取1cm2幼嫩棉花葉片，采用改良的CTAB抽提法提取樣品的總DNA[34]，利用NanoDrop2000測(cè)定DNA的濃度和質(zhì)量，將DNA稀釋到40ng/μL，置于-20℃冰箱中保存，待PCR時(shí)使用。

選用特異性引物對(duì)樣品內(nèi)的CryⅠA(c)基因進(jìn)行PCR定性檢測(cè)。上下游引物分別為5′ GAAGGATTGAGCAATCTCTAC 3′ 和5′ CAATCAGCCTAGTAAGGTCGT 3′。 PCR反應(yīng)體系：2×Taq PCR Master Mix(PC0902，北京艾德萊生物科技有限公司)10μL，上下游引物(10u/mol)各0.5μL(上海生工生物技術(shù)有限公司合成)，DNA模板2μL，雙蒸水7μL。

反應(yīng)程序采用：預(yù)變性95℃4min，變性94℃1min、退火56℃1min、延伸72℃1.5min，30個(gè)循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后總延伸72℃5min，4℃保存。擴(kuò)增基因CryⅠA(c)的目的片段長(zhǎng)度大約為340bp，使用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)[35]。出現(xiàn)相應(yīng)條帶的樣本記為陽(yáng)性結(jié)果，其余樣本記為陰性結(jié)果。

1.3.3 蛋白檢測(cè)

對(duì)PCR檢測(cè)出含有CryⅠA(c)基因的F1代樣品進(jìn)行Bt蛋白表達(dá)的定性檢測(cè)[36]。取所測(cè)樣品幼嫩葉片1cm2，按1g葉片組織對(duì)10ml水的比例加入蒸餾水，充分研磨，3000r/min離心5min，取上清，插入蛋白試紙條(金標(biāo)BT-Cry1Ab/Ac免疫檢測(cè)試劑盒，北京銀土地生物技術(shù)有限公司)，5min后觀察結(jié)果。檢測(cè)線和質(zhì)控線均出現(xiàn)紫紅色條帶的樣本記為陽(yáng)性結(jié)果，說明Bt蛋白在F1代植株體內(nèi)正常表達(dá)；檢測(cè)線未出現(xiàn)條帶，質(zhì)控線出現(xiàn)紫紅色條帶的樣本記為陰性結(jié)果，說明Bt蛋白在轉(zhuǎn)入Bt基因的F1代植株體內(nèi)未表達(dá)；檢測(cè)線和質(zhì)控線均未出現(xiàn)條帶，說明紙條存在質(zhì)量問題或試驗(yàn)中操作不當(dāng)，需重新測(cè)量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

將PCR檢測(cè)結(jié)果和蛋白試紙檢測(cè)結(jié)果均呈陽(yáng)性的樣本記為陽(yáng)性結(jié)果，將PCR檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性、蛋白試紙檢測(cè)結(jié)果呈陰性的樣本記為假陽(yáng)性結(jié)果，將PCR檢測(cè)結(jié)果和蛋白試紙檢測(cè)結(jié)果均呈陰性的樣本均計(jì)為陰性結(jié)果。記錄陽(yáng)性結(jié)果和假陽(yáng)性結(jié)果的取樣位點(diǎn)和數(shù)目。

基因漂移頻率=(含外源Bt基因并表達(dá)的F1代個(gè)體數(shù)，即陽(yáng)性結(jié)果個(gè)數(shù)/總檢測(cè)個(gè)數(shù))×100%

假陽(yáng)性頻率=(假陽(yáng)性結(jié)果個(gè)數(shù)/PCR檢測(cè)陽(yáng)性結(jié)果個(gè)數(shù))×100%

所得數(shù)據(jù)采用Duncan法多重比較常規(guī)棉品種之間和與轉(zhuǎn)基因棉不同距離之間的差異水平，采用多因素方差分析方法比較風(fēng)向和與轉(zhuǎn)基因棉花的距離二者對(duì)基因漂移影響的大小，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較定向風(fēng)和非定向風(fēng)之間的差異水平。Plt; 0.05視為有顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 處理區(qū)風(fēng)速測(cè)定結(jié)果

通過風(fēng)速測(cè)定可知(圖2)， 定向風(fēng)區(qū)(A區(qū))最高風(fēng)速為0.78m/s，最低風(fēng)速為0.39m/s；非定向風(fēng)區(qū)(B區(qū))最高風(fēng)速為0.74m/s，最低風(fēng)速為0.39m/s，對(duì)照區(qū)(C區(qū))最高風(fēng)速為0.04 m/s，最低風(fēng)速為0.01 m/s。結(jié)果表明，在不同的測(cè)量位點(diǎn)，A區(qū)和B區(qū)全程風(fēng)速均顯著高于C區(qū)(Plt;0.05)，而二者之間無顯著性差異(Pgt;0.05)，二者的區(qū)別在于前者風(fēng)向恒定，后者風(fēng)向不恒定，因而達(dá)到了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的風(fēng)速相近而風(fēng)向不同的預(yù)期效果。

圖2 A、B、C三個(gè)處理區(qū)的風(fēng)速測(cè)定結(jié)果Fig.2 The measurement of wind velocities in A, B, C treatments小寫字母表示特定樣點(diǎn)距離A、B、C區(qū)之間風(fēng)速差異的比較結(jié)果

2.2 轉(zhuǎn)基因棉花的基因漂移

2.2.1 定向風(fēng)對(duì)轉(zhuǎn)基因棉花基因漂移的影響

定向風(fēng)區(qū)(A區(qū))存在陽(yáng)性結(jié)果共計(jì)32個(gè)，對(duì)照區(qū)(C區(qū))全部取樣位點(diǎn)基因漂移頻率皆為0，A定向風(fēng)處理區(qū)發(fā)生的基因漂移頻率顯著地高于C對(duì)照處理區(qū)(Plt;0.05)。

對(duì)轉(zhuǎn)移至不同常規(guī)棉品種的基因漂移頻率進(jìn)行比較分析(表1)，結(jié)果表明在距離轉(zhuǎn)基因棉區(qū)1.6、6.4、19.2m處，SGK321的非轉(zhuǎn)基因親本石遠(yuǎn)321相對(duì)于中棉35和吉扎1號(hào)存在顯著差異，轉(zhuǎn)移至前者的基因漂移頻率顯著地高于轉(zhuǎn)移至后兩個(gè)常規(guī)棉品種。轉(zhuǎn)移至亞洲棉中棉35和海島棉吉扎1號(hào)的基因漂移頻率在所有的取樣位置并未出現(xiàn)顯著差異。

對(duì)轉(zhuǎn)移至不同距離位點(diǎn)常規(guī)棉的基因漂移頻率進(jìn)行比較分析(表1)，結(jié)果表明在距轉(zhuǎn)基因棉區(qū)的不同距離發(fā)生的基因漂移頻率呈較大波動(dòng)性變化。石遠(yuǎn)321在距轉(zhuǎn)基因棉區(qū)1.6、6.4、19.2、25.6m處檢測(cè)到基因漂移的發(fā)生，在6.4m處達(dá)到最高值33.33%，最遠(yuǎn)漂移距離為25.6m，漂移頻率在不同距離間呈現(xiàn)顯著差異(F7,16=5.481，Plt;0.05)。中棉35在距轉(zhuǎn)基因棉區(qū)6.4、19.2m處檢測(cè)到基因漂移的發(fā)生，頻率均為3.33%，最遠(yuǎn)漂移距離為19.2m，漂移頻率在不同距離間差異不顯著(F7,16=0.857，Pgt;0.05)。吉扎1號(hào)在距轉(zhuǎn)基因棉區(qū)0.8、3.2、6.4、12.8m處檢測(cè)到基因漂移的發(fā)生，漂移頻率均為3.33%，最遠(yuǎn)漂移距離為12.8m，漂移頻率在不同距離間差異不顯著(F7,16=0.571，Pgt;0.05)。

表1 定向風(fēng)區(qū)(A區(qū))SGK321發(fā)生的基因漂移頻率

平均值(±標(biāo)準(zhǔn)誤)為3次重復(fù)的均值，不同的小寫字母表示不同品種在相同距離的取樣位點(diǎn)差異顯著(Plt;0.05)

2.2.2 非定向風(fēng)對(duì)轉(zhuǎn)基因棉花基因漂移的影響

非定向風(fēng)區(qū)(B區(qū))存在陽(yáng)性結(jié)果共計(jì)40個(gè)，對(duì)照區(qū)(C區(qū))全部取樣位點(diǎn)基因漂移頻率皆為0，B非定向風(fēng)處理區(qū)發(fā)生的基因漂移頻率顯著地高于C對(duì)照處理區(qū)(Plt;0.05)。

對(duì)轉(zhuǎn)移至不同常規(guī)棉品種的基因漂移頻率進(jìn)行比較分析(表2)，結(jié)果表明在距離轉(zhuǎn)基因棉區(qū)3.2、12.8、36m處，SGK321的非轉(zhuǎn)基因親本石遠(yuǎn)321相對(duì)于中棉35和吉扎1號(hào)存在顯著差異，轉(zhuǎn)移至前者的基因漂移頻率顯著地高于轉(zhuǎn)移至后兩個(gè)常規(guī)棉品種；在距離轉(zhuǎn)基因棉區(qū)0.8、6.4m處，海島棉吉扎1號(hào)相對(duì)于石遠(yuǎn)321和中棉35存在顯著差異，轉(zhuǎn)移至前者的基因漂移頻率顯著地高于轉(zhuǎn)移至后兩個(gè)常規(guī)棉品種；在距離轉(zhuǎn)基因棉區(qū)25.6m處，轉(zhuǎn)移至石遠(yuǎn)321和吉扎1號(hào)的基因漂移頻率差異不顯著，并在此處顯著地高于轉(zhuǎn)移至中棉35的漂移頻率。中棉35在B區(qū)并未檢測(cè)出基因漂移的樣本。

對(duì)轉(zhuǎn)移至不同距離位點(diǎn)常規(guī)棉的基因漂移頻率進(jìn)行比較分析(表2)，結(jié)果表明在距轉(zhuǎn)基因棉區(qū)的不同距離發(fā)生的基因漂移頻率呈較大波動(dòng)性變化。石遠(yuǎn)321在距轉(zhuǎn)基因棉區(qū)3.2、12.8、25.6、36m處檢測(cè)到基因漂移的發(fā)生，在12.8m處達(dá)到最高值36.67%，最遠(yuǎn)漂移距離為36m，漂移頻率在不同距離間呈現(xiàn)顯著差異(F7,16=15.121，Plt;0.05)。中棉35在所有設(shè)定的取樣位置均未檢測(cè)出基因漂移的樣本。吉扎1號(hào)在距轉(zhuǎn)基因棉區(qū)0.8、6.4、12.8、25.6m處檢測(cè)到基因漂移的發(fā)生，在6.4m處達(dá)到最高值23.33%，最遠(yuǎn)漂移距離為25.6m，漂移頻率在不同距離間呈現(xiàn)顯著差異(F7,16=9.143，Plt;0.05)。

表2 非定向風(fēng)區(qū)(B區(qū))SGK321發(fā)生的基因漂移頻率

平均值(±標(biāo)準(zhǔn)誤)為3次重復(fù)的均值，不同的小寫字母表示不同品種在相同距離的取樣位點(diǎn)差異顯著(Plt;0.05)

2.2.3 定向風(fēng)和非定向風(fēng)處理間轉(zhuǎn)基因棉花基因漂移頻率的比較

對(duì)在定向風(fēng)區(qū)和非定向風(fēng)區(qū)所有取樣位點(diǎn)的基因漂移頻率進(jìn)行比較分析，結(jié)果表明，對(duì)于常規(guī)棉石遠(yuǎn)321和中棉35，定向風(fēng)區(qū)和非定向風(fēng)區(qū)檢測(cè)到的基因漂移頻率之間沒有顯著差異；而對(duì)于常規(guī)海島棉吉扎1號(hào)，定向風(fēng)區(qū)和非定向風(fēng)區(qū)檢測(cè)到的基因漂移頻率之間存在顯著差異(Plt;0.05)，非定向風(fēng)區(qū)的漂移頻率顯著地高于定向風(fēng)區(qū)(表3)。由此推測(cè)，風(fēng)向是否恒定對(duì)Bt基因漂移至海島棉吉扎1號(hào)的影響較顯著，且相對(duì)于定向風(fēng)，非定向風(fēng)可以顯著提高轉(zhuǎn)移至海島棉吉扎1號(hào)的基因漂移頻率。

表3 不同風(fēng)向因素下SGK321發(fā)生的基因漂移頻率

平均值(±標(biāo)準(zhǔn)誤)為同一常規(guī)棉品種在該處理區(qū)內(nèi)所有取樣點(diǎn)的均值，不同的小寫字母表示同一常規(guī)棉品種在定向風(fēng)區(qū)和非定向風(fēng)區(qū)差異顯著(Plt;0.05)

2.2.4 風(fēng)向和距離因素間的交互作用對(duì)轉(zhuǎn)基因棉花基因漂移的影響

對(duì)于常規(guī)棉品種石遠(yuǎn)321，風(fēng)向是否恒定對(duì)基因漂移頻率影響不顯著(F石遠(yuǎn)風(fēng)向=2.857，Pgt;0.05)，而與轉(zhuǎn)基因棉田的距離對(duì)漂移頻率存在顯著影響(F石遠(yuǎn)距離=3.706，Plt;0.05)，風(fēng)向和距離因素間的交互作用對(duì)漂移頻率影響顯著(F石遠(yuǎn)交互=14.416，Plt;0.05)。對(duì)于常規(guī)棉品種中棉35，風(fēng)向是否恒定和與轉(zhuǎn)基因棉田的距離對(duì)漂移頻率均不存在顯著影響(F中棉風(fēng)向=0.857，Pgt;0.05；F中棉距離=0.857，Pgt;0.05)。對(duì)于常規(guī)棉品種吉扎1號(hào)，風(fēng)向是否恒定和與轉(zhuǎn)基因棉田的距離對(duì)漂移頻率均存在顯著影響(F吉扎風(fēng)向=23.273，Plt;0.05；F吉扎距離=7.065，Plt;0.05)，且相對(duì)于與轉(zhuǎn)基因棉田的距離，風(fēng)向是否恒定對(duì)漂移頻率的影響更大(F吉扎風(fēng)向=23.273gt;F吉扎距離=7.065)，二者之間的交互作用顯著影響漂移頻率(F吉扎交互=4.987，Plt;0.05)。

由此可知，對(duì)于常規(guī)陸地棉(石遠(yuǎn)321)和海島棉(吉扎1號(hào))，與轉(zhuǎn)基因棉田的距離對(duì)轉(zhuǎn)移至二者的基因漂移頻率影響顯著；且相對(duì)于與轉(zhuǎn)基因棉田的距離，風(fēng)向是否恒定對(duì)轉(zhuǎn)移至常規(guī)海島棉的基因漂移影響更大。

2.2.5 基因轉(zhuǎn)入和蛋白表達(dá)的一致性分析

試驗(yàn)檢測(cè)常規(guī)棉F1代樣本共2520株，測(cè)得陽(yáng)性結(jié)果72株，假陽(yáng)性結(jié)果3株，陰性結(jié)果2445株，假陽(yáng)性頻率為4.17%。假陽(yáng)性樣本全部為石遠(yuǎn)321的F1代，中棉35和吉扎1號(hào)未測(cè)得假陽(yáng)性結(jié)果。定向風(fēng)處理檢測(cè)F1代樣本共計(jì)720株，陽(yáng)性結(jié)果32株，假陽(yáng)性結(jié)果3株，陰性結(jié)果685株，假陽(yáng)性頻率為9.38%；非定向風(fēng)處理未測(cè)得假陽(yáng)性結(jié)果。對(duì)定向風(fēng)處理和非定向風(fēng)處理的假陽(yáng)性頻率使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，結(jié)果表明，不同風(fēng)向?qū)訇?yáng)性頻率影響不顯著(Pgt;0.05)。

3 結(jié)論與討論

本研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因抗蟲棉花基因漂移的頻率最高為36.67%(非定向風(fēng)區(qū)、石遠(yuǎn)321、距轉(zhuǎn)基因棉花12.8m處)，其他研究者得到的最高漂移頻率均低于本研究結(jié)果[29,35,37- 39]。在本試驗(yàn)測(cè)定范圍內(nèi)，轉(zhuǎn)基因抗蟲棉花基因漂移最遠(yuǎn)檢測(cè)距離為36m(非定向風(fēng)區(qū)、石遠(yuǎn)321、此處漂移頻率為26.67%)。不同研究者所得到的轉(zhuǎn)基因棉花基因漂移最遠(yuǎn)距離存在明顯差異，大都介于20m至100m之間[29,35,37- 39]，但也有研究發(fā)現(xiàn)最遠(yuǎn)可達(dá)1625m[32]。本試驗(yàn)采用相對(duì)封閉的溫室環(huán)境，設(shè)置充足集中的風(fēng)力條件，可能導(dǎo)致溫室內(nèi)空氣中花粉密度的相對(duì)提高。同時(shí)相對(duì)于大田環(huán)境，溫室內(nèi)部的溫度略高，加劇了花粉微粒的布朗運(yùn)動(dòng)，增加了花粉的擴(kuò)散速率，導(dǎo)致基因漂移頻率在一定程度上增加。另外，不同轉(zhuǎn)基因花粉供體所攜帶不同目的基因的第二效應(yīng)(如在自然狀態(tài)下的發(fā)芽率和生存能力)所選用的不同轉(zhuǎn)基因花粉受體的品種特性(如自身花粉量、自交進(jìn)程速度及接受外源花粉能力)均可以在一定程度上影響基因漂移結(jié)果[40]。其他因素，諸如實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的自然條件(風(fēng)力、降雨、溫濕度)、蟲媒的種類和數(shù)量、轉(zhuǎn)基因作物釋放的面積[41]等都會(huì)影響基因漂移的最遠(yuǎn)距離。

轉(zhuǎn)基因棉花基因漂移頻率變化的趨勢(shì)是備受關(guān)注的焦點(diǎn)。相關(guān)研究證實(shí)，隨著轉(zhuǎn)基因作物種植區(qū)與非轉(zhuǎn)基因作物之間距離的增加，基因漂移頻率不斷降低[42- 43]。這是由于隨著與轉(zhuǎn)基因花粉源距離的增加，空氣中的花粉密度逐漸降低[44]。同時(shí)，在非轉(zhuǎn)基因花粉受體周圍存在其他非轉(zhuǎn)基因花粉時(shí)，不同來源的花粉相互競(jìng)爭(zhēng)導(dǎo)致了基因漂移頻率的迅速下降[45]。而本研究發(fā)現(xiàn)基因漂移頻率并未出現(xiàn)隨著與轉(zhuǎn)基因棉花距離的增加而下降的趨勢(shì)，而是呈現(xiàn)較大的波動(dòng)性。不同取樣位點(diǎn)微環(huán)境風(fēng)速的差異可能影響基因漂移頻率。為使轉(zhuǎn)基因棉區(qū)花粉充分?jǐn)U散，本試驗(yàn)在轉(zhuǎn)基因棉區(qū)設(shè)置了3臺(tái)電風(fēng)扇，這造成了A、B處理區(qū)初始取樣位點(diǎn)附近風(fēng)速的相對(duì)提高。因此，3個(gè)常規(guī)棉品種初始取樣位點(diǎn)(0.8、1.6m)檢測(cè)到的漂移頻率較小，可能與該處風(fēng)速較大有關(guān)。同時(shí)，本試驗(yàn)在定向風(fēng)區(qū)和非定向風(fēng)區(qū)每間隔4.5m設(shè)置一臺(tái)電風(fēng)扇以造成持續(xù)的風(fēng)力條件，因此每隔4.5m都存在風(fēng)速不恒定的梯度風(fēng)場(chǎng)，造成基因漂移頻率的波動(dòng)性較大。這種波動(dòng)性還可能是由于每個(gè)樣點(diǎn)采集的種子范圍和檢測(cè)數(shù)量有限造成的。另外，有研究表明基因漂移PCR檢測(cè)和蛋白檢測(cè)結(jié)果不能完全吻合，存在基因轉(zhuǎn)入但未表達(dá)的假陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果[46]。本研究發(fā)現(xiàn)假陽(yáng)性樣本3株，假陽(yáng)性頻率為4.17%，基因轉(zhuǎn)入和蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果呈現(xiàn)較高的一致性。因此，檢測(cè)方法的靈敏度也影響著基因漂移的結(jié)果。Rieger[47]等研究結(jié)果表明，在授粉媒介和花粉源的雙重效應(yīng)下，隨著與花粉源距離的增加，花粉活力下降的趨勢(shì)較不明顯，基因漂移發(fā)生的分布性較為隨機(jī)。

本試驗(yàn)設(shè)置了兩種理想狀況，即風(fēng)向恒定不變和勻速變化，發(fā)現(xiàn)非定向風(fēng)可以顯著提高轉(zhuǎn)移至海島棉吉扎1號(hào)的基因漂移頻率，且相對(duì)于與轉(zhuǎn)基因棉田的距離，風(fēng)向是否恒定對(duì)其基因漂移的影響更大。原因可能在于海島棉植株茂密，株型大，對(duì)攜帶有外源基因的花粉和人工設(shè)置的風(fēng)力在空間的傳播形成了較大的阻力；而植株內(nèi)部風(fēng)速小，增加了授粉的可能性。另外，由于風(fēng)向并不恒定，水平方向上缺少恒定氣流，因而延長(zhǎng)了花粉定向水平傳送的時(shí)間，影響花粉顆粒的沉降速度和垂直擴(kuò)散速度等一系列復(fù)雜的因子，取樣位點(diǎn)外源花粉在空中滯留或下降，不易帶出，致使花粉易雜交。

轉(zhuǎn)基因作物與其親緣種之間的雜交是基因漂移的主要形式，也是二者之間基因流動(dòng)的證據(jù)。Dale認(rèn)為只有親緣關(guān)系較近，即僅包含在同一個(gè)屬的種之間才可能是親和的[48]。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，外源基因轉(zhuǎn)移至SGK321非轉(zhuǎn)基因親本石遠(yuǎn)321的基因漂移頻率顯著地高于轉(zhuǎn)移至亞洲棉中棉35和海島棉吉扎1號(hào)。沈法富等研究表明，在6m內(nèi)陸地棉品種之間發(fā)生的基因流高于陸地棉和海島棉品種間的基因流[39]，與本試驗(yàn)結(jié)果基本一致。這表明基因漂移的發(fā)生，不僅需要轉(zhuǎn)基因棉花的花粉漂流，而且存在著不同花粉的競(jìng)爭(zhēng)和授粉選擇。原因可能與花粉活性及其識(shí)別、接受、雜交過程有關(guān)。與中棉35相比， 石遠(yuǎn)321雖同為陸地棉， 但其為轉(zhuǎn)基因棉花SGK321的非轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)基因親本，即SGK321是由石遠(yuǎn)321轉(zhuǎn)入雙價(jià)抗蟲基因所得，二者親緣關(guān)系最近，花粉親和性和接受程度最高，因而轉(zhuǎn)移至石遠(yuǎn)321的基因漂移頻率顯著高于其他品種。SGK321屬于栽培陸地棉，是具有A、D兩染色體組的異源四倍體， 而海島棉吉扎1號(hào)亦是分為A、D兩組的異源四倍體，與SGK321的F1代形成配子時(shí)減數(shù)分裂正常，因此是可育的，但其后代會(huì)出現(xiàn)一些不孕植株，其原因是配對(duì)的染色體之間存在結(jié)構(gòu)上的細(xì)微差異，或由于不同種間基因系統(tǒng)的不協(xié)調(diào)，即基因不育。由此推測(cè)，轉(zhuǎn)基因棉花的外源基因漂移至親緣關(guān)系較近的非轉(zhuǎn)基因親本的可能性較大。

通過花粉傳播產(chǎn)生的基因漂移是自然界客觀存在的事實(shí)。影響轉(zhuǎn)基因棉花基因漂移的因素非常復(fù)雜，風(fēng)向只是其中的一個(gè)重要因素。為了進(jìn)一步明確風(fēng)媒因素對(duì)基因漂移的影響，風(fēng)速是不可忽視的因子。在未來的研究中，可利用相對(duì)封閉的條件設(shè)置不同的風(fēng)速探索其對(duì)基因漂移的影響。另外，本試驗(yàn)選擇Bt基因作為標(biāo)記基因，CpTI基因的基因漂移效率及其與Bt基因在漂移時(shí)的互作效應(yīng)需要深入研究。

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Theinfluenceofwinddirectiononpollen-mediatedgeneflowintransgenicinsect-resistantcotton

ZHU Jialin, HE Juan, NIU Jianqun, ZHANG Qingwen, LIU Xiaoxia*

DepartmentofEntomology,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing100193,China

With the extensive environment release and large scale cultivation of genetically modified (GM) crops, the ecological environment security problems, caused by transgene escape from GM crop to its non-GM counterpart and wild relatives, have appeared gradually. During the early years of breeding and seed increase, there are some uncertainty among regulators about containment measures needed to prevent the movement of regulated GM traits into adjacent fields and possibly into the human or animal food chain. Cotton, one of the wind-pollinated and highly outcrossing cash crops, is planted on millions of hectares annually and is the third most abundant GM crop.

This study investigated the occurrence of gene flow from transgenic cotton to non-transgenic cottons under closed conditions using an insect-resistant gene as a tracer marker. The selectable marker used in this study was the syntheticGFMCryⅠA(C)gene which encoded Bt insecticidal protein with resistance to cotton bollworm. In order to determine the impacts of wind direction on pollen-mediated gene flow (PGF), two greenhouse experiments under different wind conditions (directed and indirected) were establishied. The growth area for each treatment was 480m2, and the row and plant spacing was 80cm×30cm. To observe the frequency and distance of gene flow, the transgenic cotton, SGK321 (GossypiumhirsutumL.), was used as a pollen donor, and conventional varieties Shiyuan321 (GossypiumhirsutumL.), Zhongmian35 (Gossypiumhirsutum( L.) and Jizha1 (GossypiumbarbadenseL.) were applied as pollen recipients, separately. Following natural pollination under the wind conditions, the seeds were collected from each conventional varieties at varying distances and sown in pot culture. DNAs were extracted by the CTAB procedure during cotyledon period, then screened forCryⅠA(C) gene by PCR assays. The positive samples in the PCR assays were identified for Bt insecticidal protein by dipstick assay. The results showed that there was a variation of PGF with increasing distances from the donor plots. The highest frequencies of gene flow were (33.33±12.02)% at 6.4m in thg directed-wind treatment and (36.67±6.67)% at 12.8 m in the indirected-wind treatment. The maximal gene flow distance observed were 25.6m in the directed-wind treatment and 36m in the indirected-wind treatment. PGF to the island cotton (Jizha1) was higher under the indirected-wind treatment than that under the directed-wind treatment, associated with the possibility that the gargantuan island cotton could hinder the wind, leading to cross pollination. PGF to non-transgenic counterpart (Shiyuan321) was obviously higher than those to the island cotton (Jizha1) and the upland cotton (Zhongmian35), indicating that genetic relationship played an important role in cross-pollination with non-GM crops.

Such control by individual factor (wind direction) under closed conditions in affecting the occurrence of gene flow rather than open-field trial designs could also be proved very useful in studying the influence of a certain factor on the gene flow. Our research may provide some reference value for the ecological safety assessment of transgenic cotton with the aim of establishing strategies to prevent pollen dispersal.

transgenic cotton;Btgene; transgene escape; qualitative PCR; biosafety

轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專項(xiàng)(2011ZX0811-002)

2012- 07- 04;

2012- 10- 26

*通訊作者Corresponding author.E-mail: liuxiaoxia611@cau.edu.cn

10.5846/stxb201207040932

朱家林，賀娟，牛建群，張青文，劉小俠.風(fēng)向因素對(duì)轉(zhuǎn)基因抗蟲棉花基因漂移效率的影響.生態(tài)學(xué)報(bào),2013,33(21):6803- 6812.

Zhu J L, He J, Niu J Q, Zhang Q W, Liu X X.The influence of wind direction on pollen-mediated gene flow in transgenic insect-resistant cotton.Acta Ecologica Sinica,2013,33(21):6803- 6812.