張計育，渠慎春，喬玉山，章 鎮(zhèn)，①，郭忠仁，①

〔1.江蘇省·中國科學(xué)院植物研究所(南京中山植物園)，江蘇南京210014;2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，江蘇南京210095〕

在生長發(fā)育和進化過程中，植物通常會遇到生物和非生物方面的脅迫，其中，生物脅迫主要包括病原真菌、細菌和病毒感染以及昆蟲和草食動物破壞等，而非生物脅迫則主要包括鹽害、冷害、澇害以及組織器官受到傷害等［1］。各種脅迫均可誘導(dǎo)植物產(chǎn)生防御反應(yīng)，通過合成活性氧、植物抗毒素、細胞壁組成物質(zhì)、病程相關(guān)蛋白等物質(zhì)抵抗脅迫環(huán)境對植物的傷害。1970年，Loon等［2］首先在煙草花葉病毒(TMV)侵染的煙草(Nicotiana tabacum Linn.)葉片中檢測到與過敏性反應(yīng)(HR)相關(guān)的蛋白，稱為病程相關(guān)蛋白(pathogenesis-related proteins，PRs)。根據(jù)蛋白的結(jié)構(gòu)和生物功能，可將PRs分為17個亞類［3］。其中，病程相關(guān)蛋白PR-5家族的氨基酸序列與西非竹竽〔Thaumatococcus danielli(Benn.)Benth.et Hook.f.〕的甜蛋白高度同源，故其又被稱為類甜蛋白(thaumatin-like proteins，TLPs)，該蛋白具有 β-1，3 葡聚糖酶活性、蛋白酶活性、抗真菌活性以及抑制α-淀粉酶和反轉(zhuǎn)錄酶活性等多種生物學(xué)活性［4］。類甜蛋白基因(即PR5基因)是植物在受到病原微生物侵害時體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生的病程相關(guān)蛋白基因家族的重要成員之一，能夠參與多種真菌的抗性反應(yīng)過程，目前多位研 究 者 已 從 水 稻 (Oryza sativa Linn.)［5-6］、番 茄(Lycopersicon esculentum Mill.)［7］和馬 鈴薯 (Solanum tuberosum Linn.)［8］等多種植物中分離到該基因序列。

湖北海棠〔Malus hupehensis(Pamp.)Rehd.〕原產(chǎn)中國，具有較強抗性，為蘋果(M.domestic Borkh.)嫁接時重要的砧木之一。近幾年來，作者對湖北海棠病程相關(guān)蛋白基因家族的多個基因進行了克隆、測序與表達特征的分析和研究［9-12］，但其中并未涉及PR5基因。

為了能夠更加全面了解湖北海棠PR5基因(MhPR5)的生物學(xué)功能，作者采用特異引物從湖北海棠基因組DNA和經(jīng)水楊酸處理的全長cDNA文庫中分別克隆獲得PR5基因的基因組DNA序列和cDNA序列，利用多種生物信息學(xué)軟件對MhPR5基因的核苷酸序列及其推導(dǎo)出的氨基酸序列進行分析并與其他物種PR5基因的氨基酸序列進行對比;此外，還利用實時熒光定量RT-PCR技術(shù)分析了MhPR5基因在湖北海棠各組織(根、莖和葉)中的表達特性及其在非生物脅迫(4℃低溫和200 mmol·L-1NaCl)和生物脅迫〔蘋果輪紋病病原菌(Physalospora piricola Nose)和蘋果蚜蟲(Aphis citricola van der Goot)〕條件下的表達特性，以期為湖北海棠抗逆機制的相關(guān)研究以及通過基因工程技術(shù)培育蘋果抗逆新種質(zhì)奠定理論基礎(chǔ)，并為類甜蛋白基因功能及其在植物抗病過程中的作用機制研究提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

實驗用湖北海棠組培苗由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)郝玉金教授贈送;經(jīng)水楊酸處理的湖北海棠全長cDNA文庫由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院果樹生物技術(shù)實驗室提供［13］。使用的 dNTPs、DL2000 Marker、rTaq DNA 聚合酶、DNA消化酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和pMD18-T載體等均購于寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 MhPR5基因的克隆和測序 取湖北海棠組培苗葉片，參照文獻［14］的方法進行基因組DNA的提取和其中RNA的消化;將基因組DNA和全長cDNA文庫均稀釋10倍后用于MhPR5基因的克隆。

根據(jù)GenBank中登錄的蘋果PR5基因序列(登錄號DQ318213)設(shè)計特異引物PR5F1和PR5R1，引物序列分別為5'-ATGATGAAGAGCCAAGCAGC-3'和5'-GTAATCCCATTTCGTGCTTATG-3'。全長 cDNA文庫和基因組DNA的MhPR5基因的擴增條件相同，反應(yīng)體系總體積均為25 μL;反應(yīng)體系具體組成、PCR反應(yīng)程序、PCR產(chǎn)物檢測及目的片段的回收和克隆等操作均與文獻［10］相同。將PCR鑒定呈陽性的克隆交由華大生物技術(shù)有限公司完成測序。

1.2.2 MhPR5基因核苷酸及其編碼氨基酸的序列分析 參照文獻［10］的分析方法進行相關(guān)序列分析。將測序得到的MhPR5基因的核苷酸序列及其推導(dǎo)出的氨基酸序列分別在NCBI(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov)上用BLASTn和BLASTp進行序列相似性分析;并利用BioEdit中的Clustal W程序?qū)⑺鼈兣cGenBank數(shù)據(jù)庫中收錄的擬南芥〔Arabidopsis thaliana(Linn.)Heynh.〕、蘋果和梨〔Pyrus pyrifolia(Burm.f.)Nakai〕的PR5基因序列進行多序列比對，分析序列中存在的保守氨基酸殘基和結(jié)構(gòu)域;采用ProtParam(http:∥au.expasy.org/tools/protparam.html)分析MhPR5基因編碼的蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量及等電點等理化性質(zhì);利用Signal P程序(http:∥genome.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析該蛋白質(zhì)N-末端的信號肽序列。

1.2.3 MhPR5基因的表達特性分析 將湖北海棠組培苗進行生根培養(yǎng)，培養(yǎng)條件和生根培養(yǎng)基配方參照文獻［10］;生根培養(yǎng)3周后分別取組培苗的根、莖和葉進行MhPR5基因組織表達特性分析，各重復(fù)3次。

對生根培養(yǎng)3周的組培苗分別進行蘋果輪紋病病原菌和低溫處理。蘋果輪紋病病原菌的處理方法參照文獻［15］，具體操作過程:將蘋果輪紋病病原菌接種于PDA培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1周后，用黑光燈進行照射培養(yǎng)，誘導(dǎo)蘋果輪紋病病原菌產(chǎn)生孢子;收集蘋果輪紋病病原菌的分生孢子，制成密度約1×106mL-1的懸浮液噴灑于湖北海棠組培苗葉片表面，分別于培養(yǎng)0、3、6、12、24、48、72 和 96 h 取葉片，迅速置于液氮中冷凍后保存于-70℃冰箱中，備用。低溫處理方法:將湖北海棠組培苗置于4℃培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)0、4、12和48 h，取葉片迅速置于液氮中冷凍，并保存于-70℃冰箱中，備用。

于2010年5月上旬對2年生湖北海棠盆栽苗分別進行NaCl和蘋果蚜蟲處理。NaCl處理方法:用200 mmol·L-1NaCl溶液對盆栽苗進行澆灌，每盆約500 mL;分別于處理后0、4、12和48 h取葉片，迅速置于液氮中冷凍后保存于-70℃冰箱中，備用。蘋果蚜蟲處理方法:將蘋果蚜蟲置于盆栽苗葉片上侵染1周，分別取經(jīng)過和未經(jīng)過蘋果蚜蟲侵染的葉片，迅速置于液氮中冷凍后保存于-70℃冰箱中，備用。以上實驗每處理均為4株苗，各重復(fù)3次。

參照文獻［13，16-17］的方法提取總 RNA，并根據(jù)DNA消化酶(產(chǎn)品編號D2215)說明書中的方法對總RNA中的DNA進行消化;取1 μg經(jīng)過消化的總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄說明書中的操作步驟合成cDNA的第1鏈，稀釋10倍后置于-20℃保存，備用。根據(jù)克隆獲得的 MhPR5基因序列設(shè)計特異引物，引物PR5F2的序列為5'-CATGTCCTCCCACAGAGTAC-3'，引物PR5R2的序列為5'-ATATAATCCCATTTCGT GCTTATG-3';參照文獻［15］進行內(nèi)參基因Mhtubulin引物的序列設(shè)計，引物TF的序列為5'-AGGATGCTA CAGCCGATGAG-3'，引物TR的序列為5'-GCCGAA GAACTGACGAGAATC-3'。參考張計育等［15］的方法進行實時熒光定量RT-PCR分析;數(shù)據(jù)分析采用7300 Real Time PCR System 軟件和 2-ΔΔCT方法［18］進行。為了確保反應(yīng)產(chǎn)物的準(zhǔn)確性和單一性，隨機挑取3個PCR產(chǎn)物的陽性克隆進行測序。

2 結(jié)果和分析

2.1 MhPR5基因的克隆與序列分析

利用特異引物PR5F1和PR5R1從湖北海棠基因組DNA和經(jīng)水楊酸處理的全長cDNA文庫中分離出MhPR5基因，擴增產(chǎn)物的電泳結(jié)果見圖1。測序結(jié)果表明:湖北海棠MhPR5基因全編碼區(qū)的cDNA序列長度為741 bp，共編碼246個氨基酸殘基;從湖北海棠基因組DNA獲得的MhPR5基因編碼區(qū)序列長度為1 106 bp，含有1個長度為365 bp的內(nèi)含子，內(nèi)含子的接頭序列分別為TA和TG。ProtParam分析結(jié)果表明:MhPR5基因編碼的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量為25 520，等電點為 pI 4.72。

圖1 從基因組DNA和經(jīng)水楊酸處理的全長cDNA文庫中獲得的湖北海棠MhPR5基因的電泳圖譜Fig.1 Electrophoretogram of MhPR5 gene of Malus hupehensis(Pamp.)Rehd.obtained from genomic DNA and full-length cDNA library treated by salicylic acid

2.2 MhPR5基因與其他植物PR5基因編碼的氨基酸序列比較分析

相似性比較分析結(jié)果表明:湖北海棠MhPR5基因的核苷酸序列與蘋果、梨、桃〔Prunus persica(Linn.)Batsch.〕和甜櫻桃(P.avium Linn.)PR5 基因核苷酸序列(GenBank登錄號分別為 DQ318213、FJ201995、AF362988和 U32440)的同源性分別為98%、95%、82%和75%;MhPR5基因編碼的氨基酸序列與蘋果、梨和桃PR5基因編碼的氨基酸序列(GenBank登錄號分別為 AAX19849、ACN97417和 AAM00216)的同源性分別為97%、94%和52%。

湖北海棠MhPR5基因與其他植物PR5基因編碼的氨基酸序列的比對結(jié)果(圖2)表明:MhPR5基因編碼的蛋白質(zhì)含有16個保守的半胱氨酸殘基，蘋果和梨PR5基因編碼的蛋白質(zhì)也含有同樣的16個保守的半胱氨酸殘基，與擬南芥中類甜蛋白的氨基酸序列結(jié)構(gòu)組成相似［19］，說明該基因序列在物種間具有保守性;在MhPR5基因以及蘋果、梨和擬南芥PR5基因編碼的氨基酸序列中還含有5個保守的帶負(fù)電荷的氨基酸殘基，這5個氨基酸殘基可以在PR5蛋白中形成酸性裂縫［20-22］。另外，在MhPR5基因編碼的氨基酸序列的N端還含有1個由25個氨基酸殘基組成的信號肽。

圖2 湖北海棠MhPR5基因與其他植物PR5基因編碼的氨基酸序列的比對結(jié)果Fig.2 Comparison result of amino acid sequences encoded by MhPR5 gene of Malus hupehensis(Pamp.)Rehd.and PR5 gene of other species

2.3 MhPR5基因的表達特性分析

2.3.1 組織表達特性分析 利用Mhtubulin作為內(nèi)參基因，通過實時熒光定量RT-PCR技術(shù)對MhPR5基因在生根培養(yǎng)3周的湖北海棠組培苗葉、莖和根中的表達特性進行了分析，結(jié)果見圖3。MhPR5基因在湖北海棠組培苗根、莖和葉中均有表達，且在葉中的相對表達量最低，在莖中的相對表達量略高，在根中的相對表達量最高。

圖3 湖北海棠組培苗不同組織中MhPR5基因相對表達量的比較Fig.3 Comparison of relative expression of MhPR5 gene in different tissues of tissue culture seedlings of Malus hupehensis(Pamp.)Rehd.

2.3.2 生物脅迫條件下的表達特性分析 實時熒光定量RT-PCR分析結(jié)果(圖4)表明:在蘋果輪紋病病原菌分生孢子和蘋果蚜蟲侵染條件下，MhPR5基因的表達特性有明顯差異。蘋果輪紋病病原菌處理6 h后，MhPR5基因的相對表達量最高，為處理前(處理0 h)的11.34倍，隨后相對表達量逐漸降低(圖4-A);被蘋果蚜蟲侵染后，MhPR5基因的相對表達量明顯提高，為處理前的14.33倍(圖4-B)。

2.3.3 非生物脅迫條件下的表達特性分析 在200 mmol·L-1NaCl和4℃低溫2種非生物脅迫條件下，MhPR5基因表達特性的實時熒光定量RT-PCR分析結(jié)果見圖5。結(jié)果表明:經(jīng)200 mmol·L-1NaCl處理12 h后，MhPR5基因的相對表達量最高，為處理前(處理0 h)的2.25倍，隨后相對表達量降低，且處理4和48 h后該基因的相對表達量均低于處理前(圖5-A);在4℃低溫處理48 h內(nèi)，MhPR5基因的相對表達量呈先降低后升高的趨勢，且在處理12 h內(nèi)相對表達量均低于處理前，處理48 h后相對表達量最高，為處理前的3.17倍(圖5-B)。

3 討論和結(jié)論

類甜蛋白最重要的結(jié)構(gòu)特征為其分子結(jié)構(gòu)中具有由16個半胱氨酸殘基配對形成的8個二硫鍵，由于這些二硫鍵的存在，該蛋白質(zhì)才具有相對穩(wěn)定的化學(xué)結(jié)構(gòu)，能夠抗熱、抗酶解和抗酸堿［23］。本研究分離出的湖北海棠MhPR5基因編碼的蛋白質(zhì)含有16個保守的半胱氨酸殘基，與擬南芥等種類所包含的類甜蛋白的氨基酸序列結(jié)構(gòu)組成相似，說明PR5基因序列在物種間具有保守性;該基因編碼的氨基酸序列還有5個保守的帶負(fù)電荷的氨基酸殘基，它們在PR5蛋白中可以形成酸性裂縫，說明從湖北海棠中分離得到的基因是類甜蛋白基因。

類甜蛋白基因在植物的特定組織和器官中通常表現(xiàn)為低水平組成型表達且表達特性不同。草莓(Fragaria×ananassa Duch.)類甜蛋白基因在植株的葉和花冠中的表達量最大，在根中的表達量中等，在未成熟果實中的表達量最?。?4］。本研究中，湖北海棠MhPR5基因在各組織中的表達量也存在一定差異，在根中的相對表達量最高、葉中最低。說明在不同物種中PR5基因的表達存在較大差異。

湖北海棠類甜蛋白MhPR5基因是植物在受到病原微生物侵害時體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生的病程相關(guān)蛋白基因家族的重要成員之一，參與多種真菌抗性反應(yīng)過程。Datta等［25］在水稻中過量表達水稻的類甜蛋白基因，獲得的轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出抗水稻紋枯病〔Thanatephorus cucumeris(Frank)Donk〕特性;Chen等［26］將水稻的類甜蛋白基因?qū)胄←?Triticum aestivum Linn.)體內(nèi)，獲得的轉(zhuǎn)基因植株對小麥赤霉病(Fusarium graminearum Schw.)具有一定的抗性;Jayasankar等［27］發(fā)現(xiàn)過量表達類甜蛋白基因可以增強葡萄(Vitis vinifera Linn.)對炭疽病〔Glomerella cingulate(Stonem.)Schr.et Spanld.〕的抗性。本研究中，經(jīng)蘋果輪紋病病原菌分生孢子侵染6 h，MhPR5基因的相對表達量顯著升高并達到最大值，說明MhPR5基因參與湖北海棠對蘋果輪紋病的抵抗。另外，在受到植食昆蟲取食時可誘導(dǎo)植物體內(nèi)的類甜蛋白基因大量表達，如被麥二叉蚜(Schizapnis graminum Rondani)取 食 后 高 粱 〔Sorghum bicolor(Linn.)Moench〕體內(nèi)的類甜蛋白基因的轉(zhuǎn)錄水平增加數(shù)千倍［28］。本研究結(jié)果也表明:受到蘋果蚜蟲侵染后，湖北海棠MhPR5基因的相對表達量較侵染前顯著增加。

病程相關(guān)蛋白(PRs)在植物抵抗非生物脅迫的過程中也起著非常重要的作用。已有研究表明:逆境條件可誘導(dǎo)植物體內(nèi)PR基因的表達［29］;ABA和干旱脅迫可以誘導(dǎo)水稻體內(nèi)內(nèi)切葡聚糖酶基因的表達［30］;干旱可以誘導(dǎo)茶樹〔Camellia sinensis(Linn.)Kuntze〕體內(nèi)類甜蛋白基因的表達［31］。本研究中，經(jīng)200 mmol·L-1NaCl處理12 h和4℃低溫處理48 h后，MhPR5基因的相對表達量均較處理前(處理0 h)明顯增加，說明MhPR5基因在抵抗非生物脅迫的過程中起著非常重要的作用。

綜合分析結(jié)果表明:類甜蛋白的氨基酸序列在物種間具有保守性，含有16個保守的半胱氨酸殘基和5個保守的帶負(fù)電荷的氨基酸殘基。MhPR5基因在湖北海棠各組織中的表達量有一定差異，在抵抗生物和非生物脅迫過程中可能起著非常重要的作用，蘋果輪紋病病原菌、蘋果蚜蟲、200 mmol·L-1NaCl和4℃低溫均可以誘導(dǎo)MhPR5基因的表達。

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