王 軍，尚鳳偉，朱登納，王寶珍，張冬秀，張貞煥，馬潔瓊

鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院腦癱康復(fù)科 鄭州450052

△女，1963年7月生，博士，教授，主任醫(yī)師，研究方向:小兒神經(jīng)疾病的康復(fù)治療，E-mail:swangjun@zzu.edu.cn

缺氧缺血性腦損傷(hypoxic-ischemic brain damage，HIBD)是圍產(chǎn)期導(dǎo)致新生兒死亡及遺留神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥的重要原因，目前各種治療方法療效有限。銀杏內(nèi)酯B(ginkgolide B，GB)是銀杏葉提取物中主要的藥效成分之一，為二萜類(lèi)酸化合物，廣泛用于心腦血管、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。有研究［1］表明，GB 對(duì)短暫性及永久性局灶性大腦中動(dòng)脈阻塞模型大鼠和小鼠均具有保護(hù)作用。Caspase-3 是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵分子，在凋亡信號(hào)傳導(dǎo)的許多途徑中發(fā)揮作用。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是一種內(nèi)皮細(xì)胞特異的強(qiáng)效有絲分裂原，有促內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，可誘導(dǎo)血管及淋巴管的生成，因此VEGF 的表達(dá)對(duì)改善腦缺血灶周?chē)膫?cè)支循環(huán)，促進(jìn)腦功能的恢復(fù)具有重要意義。作者觀察了GB對(duì)HIBD 新生大鼠腦組織Caspase-3 和VEGF mRNA表達(dá)的影響，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料 清潔級(jí)新生7 d 齡健康SD大鼠96 只，體質(zhì)量12～16 g，由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供;GB 購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院生物藥品檢定所;體積分?jǐn)?shù)8%O2+體積分?jǐn)?shù)92%N2混合氣體購(gòu)于北京普萊克斯氣體公司;Trizol(Invitrogen 公司);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量PCR 儀(SYBR GreenⅠ染料法)，北京康為世紀(jì)公司;熒光定量PCR 儀，美國(guó)Applied Biosystems 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 動(dòng)物按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組(n=24)、模型組(n =24)、GB 低劑量組(n =24)及GB 高劑量組(n =24)。模型組、GB 低劑量組及GB 高劑量組采用經(jīng)典Rice 法［2］制作HIBD 動(dòng)物模型:乙醚麻醉后將動(dòng)物置于手術(shù)臺(tái)上，分離并兩端結(jié)扎左側(cè)頸總動(dòng)脈，中間剪斷，術(shù)后放回母鼠身邊恢復(fù)0.5～1.0 h 后，放入常壓缺氧箱中，箱內(nèi)放置鈉石灰，用以吸收動(dòng)物排出的CO2，以1.0～1.5 L/min的速度向容器內(nèi)輸入混合氣體，持續(xù)2.5 h 后，放回母鼠身邊繼續(xù)飼養(yǎng)。假手術(shù)組只分離不結(jié)扎左側(cè)頸總動(dòng)脈，不行缺氧處理。模型制作4 h 后，GB 低劑量組及GB 高劑量組分別以5 和10 mg/kg 腹腔注射GB，給藥容積10 mL/kg，余2組給等量生理鹽水，1次/d，共5 d。

1.3 標(biāo)本取材 造模后第3、7、14 及28 天，各組分別隨機(jī)抽取6 只大鼠處死，處死前稱(chēng)質(zhì)量，斷頭取腦，取左側(cè)腦組織分裝于凍存管中，立即置液氮中快速冷凍，隨后于－80℃冰箱保存。

1.4 腦組織Caspase-3 和VEGF mRNA 的檢測(cè)采用熒光定量PCR 法。腦組織標(biāo)本在液氮中研磨，按Trizol 試劑及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)抽提RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 后，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。根據(jù)GenBank中β-actin 及目的基因序列，利用Primer 5.0 設(shè)計(jì)引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成(表1)。采用兩步法PCR 反應(yīng)，反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性10 min，(95℃變性15 s+60℃退火延伸1 min)×35 個(gè)循環(huán)，得到每個(gè)樣品的Ct 值。采用2－ΔΔCt法計(jì)算目的基因的表達(dá)量，ΔΔCt=(Ct目的基因－Ct內(nèi)參)實(shí)驗(yàn)組－(Ct目的基因－Ct內(nèi)參)對(duì)照組。

表1 PCR 引物序列及產(chǎn)物

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，不同時(shí)間、同一時(shí)間點(diǎn)4組間腦組織Caspase-3 與VEGF mRNA 表達(dá)量的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t 法檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物一般情況 動(dòng)物缺氧過(guò)程中出現(xiàn)躁動(dòng)、翻滾、皮膚發(fā)紺、頭部顫動(dòng)等表現(xiàn)。HIBD 后動(dòng)物出現(xiàn)不同程度的行為學(xué)異常，如喂養(yǎng)困難、活動(dòng)減少、體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢等。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中沒(méi)有動(dòng)物死亡。

2.2 4組大鼠腦組織Caspase-3 與VEGF mRNA的表達(dá) 熒光定量PCR 產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖見(jiàn)圖1。模型組、GB 低劑量組及GB 高劑量組Caspase-3 mRNA 的表達(dá)均于造模后第3 天達(dá)最高，此后逐漸下降，第28 天時(shí)接近基線(xiàn)水平。這3組VEGF mRNA 的表達(dá)于造模后第3 天達(dá)最高，此后下降，模型組下降較快，GB 低劑量組及GB 高劑量組下降趨勢(shì)相對(duì)緩慢。假手術(shù)組兩個(gè)指標(biāo)各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表2、3。

圖1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖

表2 4組大鼠腦組織Caspase-3 mRNA 的表達(dá)

表3 4組大鼠腦組織VEGF mRNA 的表達(dá)

3 討論

新生兒HIBD 是導(dǎo)致新生兒腦損傷及后遺腦性癱瘓的常見(jiàn)原因，近年來(lái)由于高危妊娠增多及新生兒搶救成功率的提高，HIBD 的發(fā)病率有增高趨勢(shì)，但目前對(duì)此病的治療效果不佳［3-5］。GB 是從銀杏葉中提取的一種天然的血小板活化因子(plateletactivating factor，PAF)受體拮抗劑，是銀杏內(nèi)酯中神經(jīng)保護(hù)作用最顯著的成分之一，有抗氧化、抗炎及抗細(xì)胞凋亡作用［6-7］。季秋虹等［8］用GB 預(yù)處理原代培養(yǎng)的小鼠皮層神經(jīng)元，再進(jìn)行嚴(yán)重缺血損傷處理，觀察神經(jīng)元Caspase-3 蛋白表達(dá)的變化，發(fā)現(xiàn)GB 預(yù)處理可促進(jìn)缺血神經(jīng)元增殖，抑制Caspase-3 的活化，降低神經(jīng)細(xì)胞凋亡比率。HIBD 后神經(jīng)細(xì)胞中伴有多種凋亡相關(guān)基因的表達(dá)及蛋白的合成，Caspase-3 作為細(xì)胞凋亡最關(guān)鍵的效應(yīng)蛋白酶，在損傷區(qū)的細(xì)胞凋亡過(guò)程中起決定性作用［9］。研究［10］表明正常人腦神經(jīng)元中幾乎無(wú)Caspase-3 蛋白表達(dá)，而在腦缺血時(shí)神經(jīng)元中Caspase-3 蛋白表達(dá)明顯升高［11-12］。

該研究結(jié)果顯示，模型組大鼠HIBD 后第3 天腦組織Caspase-3 表達(dá)明顯增加，此后雖逐漸降低，但直到術(shù)后第28 天仍高于假手術(shù)組;GB 高、低劑量組HIBD 后腦組織Caspase-3 表達(dá)較模型組明顯降低，其中高劑量組降低更加顯著。說(shuō)明HIBD 后腦組織Caspase-3 表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞凋亡增加;應(yīng)用GB后可顯著下調(diào)Caspase-3 的表達(dá)，減少細(xì)胞凋亡，從而減少腦損傷。Hostettler 等［13］在培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞時(shí)加入0.02～2.00 mg PAF，72 h后細(xì)胞死亡增多，加入GB 可顯著減少細(xì)胞死亡，而各種濃度的PAF 均可使Caspase-3 表達(dá)增多，這與該研究結(jié)果相一致。作者的觀察結(jié)果還顯示HIBD誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡可持續(xù)至傷后4 周甚至更久，因此臨床治療此類(lèi)疾病時(shí)可適當(dāng)延長(zhǎng)治療的時(shí)間窗。

VEGF 是一類(lèi)促進(jìn)血管再生，增加血管通透性的細(xì)胞因子，調(diào)控其表達(dá)的因素很多，缺血或低氧是誘導(dǎo)VEGF 表達(dá)的最主要因素［14］。有研究［15］發(fā)現(xiàn)，GB 可顯著上調(diào)星形膠質(zhì)細(xì)胞VEGF mRNA 的表達(dá)。該研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠HIBD 后，腦組織VEGF 的表達(dá)明顯增加，術(shù)后第14 天才降至正常水平;GB 高、低劑量組腦組織同時(shí)間點(diǎn)VEGF 的表達(dá)較模型組增加，高劑量組的效果更顯著，直到術(shù)后第28 天仍高于正常水平。腦缺血發(fā)生時(shí)，VEGF 表達(dá)增加對(duì)損傷腦組織起著多重修復(fù)作用，涉及促進(jìn)血管形成、誘導(dǎo)神經(jīng)發(fā)生、直接的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)和保護(hù)作用及抗凋亡等多重機(jī)制［16-18］。該研究結(jié)果提示:GB可能通過(guò)上調(diào)VEGF 的表達(dá)，促進(jìn)腦損傷區(qū)血管的形成，改善細(xì)胞微環(huán)境，發(fā)揮神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)及保護(hù)作用，并對(duì)損傷區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖遷移產(chǎn)生積極的影響，從而對(duì)損傷腦組織進(jìn)行修復(fù)。

綜上所述，GB 可以下調(diào)腦損傷誘導(dǎo)的Caspase-3 表達(dá)，上調(diào)VEGF 表達(dá)，從而降低腦損傷后細(xì)胞凋亡并改善損傷區(qū)微環(huán)境，促進(jìn)腦損傷的修復(fù)，高劑量效果更加明顯。這將為HIBD 的治療提供新的思路，為GB 的臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

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