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THP-1細(xì)胞系白血病干細(xì)胞的檢測、分選及鑒定

2013-12-17 07:39王穎超殷楚云魏永緯馬麗娜王春美盛光耀
關(guān)鍵詞:亞群表型白血病

王穎超,馮 磊,殷楚云,魏永緯,馬麗娜,王春美,盛光耀

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科;河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科開放實驗室 鄭州450052

△男,1970年12月生,碩士,副教授,研究方向:兒童血液與腫瘤方向,E-mail:yingchaowang152@163.com

急性白血病(acute leukemia,AL)是起源于造血干細(xì)胞的惡性克隆性疾病,發(fā)病率較高,在兒童和青少年惡性腫瘤中發(fā)病率居首位[1],其中兒童急性髓細(xì)胞白血病(acute myelocytic leukemia,AML)治療難度較大(除隱性早幼粒細(xì)胞白血病外),雖然目前完全緩解率顯著提高[2],但耐藥和復(fù)發(fā)仍然非常普遍,長期生存率更低[3]。AML 與干細(xì)胞關(guān)系非常密切,白血病患者體內(nèi)存在極小一群非常特殊的細(xì)胞,即白血病干細(xì)胞(leukemia stem cells,LSCs),LSCs對常規(guī)的化療藥物不敏感,AML 的發(fā)生、復(fù)發(fā)均與這一小群LSCs 有關(guān)[4]。作者以人急性單核細(xì)胞白血病THP-1 細(xì)胞為研究對象,通過流式細(xì)胞術(shù)檢測、分選CD34+CD38-的細(xì)胞,并進(jìn)一步觀察其生物學(xué)特性,為下一步深入研究LSCs 的特異表面標(biāo)志分子和靶向治療等后續(xù)工作打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、細(xì)胞株及試劑 非肥胖糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠40 只,6~8 周齡,雌雄不限,體質(zhì)量約15 g,購自北京華阜康生物科技股份有限公司。THP-1 細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫研究所。碘化丙啶(PI)、阿糖胞苷(Sigma 公司,美國),青、鏈霉素(索萊寶公司,中國),改良型RPMI 1640 培養(yǎng)基、優(yōu)級胎牛血清(Hyclone 公司,美國),小鼠抗人CD34-PE 單克隆抗體、小鼠抗人CD38-FITC 單克隆抗體、小鼠抗人IgG1-PE、小鼠抗人IgG1-FITC(eBioscience 公司,美國),組織RNA 提取試劑盒(Biomiga 公司,美國),MMLV 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR 擴(kuò)增試劑盒(Fermentas 公司,立陶宛),DNA Marker、引物合成(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) THP-1 細(xì)胞用含體積分?jǐn)?shù)20%胎牛血清、體積分?jǐn)?shù)1%青鏈霉素的RPMI 1640 完全培養(yǎng)基,在37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),每隔48 h 換液傳代。

1.3 LSCs 的檢測及分選 取對數(shù)生長期的THP-1細(xì)胞,1 500 r/min 離心10 min,離心2 次,加PBS 制成單細(xì)胞懸液(106mL-1),加入3 只試管,分別加入以下單克隆抗體試劑:鼠抗人CD34-PE 和鼠抗人CD38-FITC,同型對照分別加入IgG1-PE、IgG1-FITC,同時設(shè)置陰性對照。充分混勻后4℃下避光染色20 min。染色完成后1 000 r/min 離心10 min,洗滌2 次,加入PBS 稀釋樣本至500 μL,重懸細(xì)胞,上流式細(xì)胞儀測定,采用CELLQUEST 軟件分析。打開分選軟件,設(shè)置左右收集的細(xì)胞群;換上偏振板,調(diào)整參數(shù),使偏振板在最佳位置,打開左、右分選通道,使左右兩條液流分開,開始分選;待收集結(jié)束,離心收集細(xì)胞。重復(fù)測量10 次。

1.4 細(xì)胞周期的檢測 取分選后的LSCs組、非LSCs組單細(xì)胞懸液,離心洗滌,加入配好的PI 及透膜劑,室溫下避光孵育20 min,10 g/L 多聚甲醛固定24 h 以上,上機(jī)前過濾細(xì)胞以防部分聚集成團(tuán)的細(xì)胞堵管。收集10 000 個細(xì)胞,記錄并分析G0/G1、S和G2/M 期細(xì)胞的比例。

1.5 ABCG2、ABCB1、Bcl-2、Bax 基因表達(dá)的檢測采用實時熒光定量PCR 方法,根據(jù)試劑盒說明書對分選后LSCs 和非LSCs 提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA 后-70℃保存或直接進(jìn)行熒光定量PCR 反應(yīng),以GAPDH 為內(nèi)參。使用ABI7500 光定量PCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增。GAPDH 上游引物序列5'-AC CACAGTCCATGCCATCAC-3',下游引物序列5'-TC CACCACCCTGTTGCTGTA-3';ABCG2:上游引物序列5'-GTCTAAGCAGGGACGAACAATC-3',下 游 引 物 序列5'-GCCAATAAGGTGAGGCTATCAA-3';ABCB1 上游引物序列5'-TGGTGTTTGGAGAAATGACAGAT-3',下游引物序列5'-GAAACCTGAATGTAAGCAGCAAC-3';Bcl-2 上游引物序列5'-GTGGATGACTGAATAC CTGAACC-3',下游引物序列5'-AGACAGCCAG GAGAAATCAAAC-3';Bax 上游引物序列5'-GGTT GTCGCCCTTTTCTACTT-3',下游引物序列5'-GT GAGGAGGCTTGAGGAGTCT-3'。反應(yīng)體系反應(yīng)條件:98℃預(yù)變性2 min;98℃變性10 s,55℃退火15 s,72℃延伸40 s,40 個循環(huán);72℃再延伸8 min。

1.6 NOD/SCID 小鼠白血病模型建立 將35 只NOD/SCID 小鼠隨機(jī)分成7組,每組5 只,A~C組經(jīng)尾靜脈分別注射104、105、106個非LSCs;D~F組分別注射103、104、105個LSCs;G組(陰性對照組)經(jīng)尾靜脈或腹腔注射無菌PBS,注射劑量均為0.2 mL。自接種日起每日觀察小鼠成瘤情況,記錄各組小鼠生存時間。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0 處理數(shù)據(jù)。應(yīng)用兩獨(dú)立樣本的t 檢驗比較LSCs組、非LSCs 細(xì)胞周期及ABCG2、ABCB1、Bcl-2、Bax 基因水平的差異。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 LSCs 的分選 重復(fù)測量10 次,THP-1 細(xì)胞株中存在免疫表型為CD34+CD38-的LSCs,比例為(0.12±0.06)%;收集分選后LSCs 管細(xì)胞再次上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測,細(xì)胞集中于之前的LSCs 區(qū)域,比例為(97.00±1.70)%。

2.2 LSCs 細(xì)胞和非LSCs 細(xì)胞細(xì)胞周期分析 見表1。

表1 細(xì)胞周期分析 %

2.3 LSCs 細(xì)胞和非LSCs 細(xì)胞不同基因表達(dá)水平的比較 見表2。

表2 LSCs 細(xì)胞和非LSCs 細(xì)胞不同基因表達(dá)水平的比較

2.4 不同分組小鼠成瘤情況比較 小鼠在接受不同處理后,除E組和G組各有1 只在觀察過程中死亡,余均存活4 周以上。1×103數(shù)量的LSCs 可在4周后形成典型的NOD/SCID 小鼠白血病浸潤模型,非LSCs 至少需要1×106才能成瘤,成瘤率遠(yuǎn)低于LSCs 移植組。LSCs組小鼠多在發(fā)病后1~2 周內(nèi)死亡,平均生存時間為(31±2)d,而非LSCs組平均生存時間為(39±2)d,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t =7.124,P <0.001)。

3 討論

LSCs 因具有自我更新、多向分化和無限增殖的能力,可能是導(dǎo)致白血病耐藥及復(fù)發(fā)的根源[5]。然而,由于缺乏高度特異的細(xì)胞免疫表型,使得LSCs的分離純化一直是亟待解決的難題之一。Feller等[6]報道了免疫表型為CD133+和(或)CD34+的人AML LSCs。LSCs 細(xì)胞表型可能還包括CD123[7]、CD96[8]、CLL-1[9]、CD47[10]、CD44[11]等。諸多LSCs免疫表型存在爭議,但是CD34、CD38 仍作較經(jīng)典的白血病起始細(xì)胞表面標(biāo)志被許多研究所采用。該研究結(jié)果顯示,在對數(shù)生長期的THP-1 細(xì)胞中,CD34+CD38-細(xì)胞的比例為(0.12±0.06)%。

研究[12]發(fā)現(xiàn),90%以上的LSCs 處于細(xì)胞分裂周期的G0期,干細(xì)胞生長因子等一般難以把這些LSCs 從G0期活化刺激進(jìn)入細(xì)胞增殖周期。該研究也發(fā) 現(xiàn),LSCs G0/G1期 細(xì) 胞 比例 達(dá)(94.03±1.61)%,明顯高于非LSCs,初步證實在THP-1 細(xì)胞中確有小部分細(xì)胞處于細(xì)胞周期中的靜止?fàn)顟B(tài),即LSCs。這些LSCs 比普通白血病細(xì)胞更能有效地抵御化療藥物的傷害,并能產(chǎn)生藥物耐受。

ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)體的高表達(dá)可以將許多抗腫瘤藥物逆向轉(zhuǎn)運(yùn)出到細(xì)胞外,使抗腫瘤藥物不能進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)積聚發(fā)揮作用,也是LSCs 耐藥的主要原因之一。AML 患者中LSCs 相對于骨髓造血干細(xì)胞有更高的ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)體相關(guān)基因ABCB1 和ABCG2 的表達(dá)[13]。該研究結(jié)果顯示:LSCs 亞群ABCG2 和ABCB1 基因的表達(dá)水平明顯高于非LSCs 亞群,亦證實了這一點(diǎn)。

凋亡逃逸也是造成LSCs 耐藥的主要原因之一[14]。Bcl-2/Bax 比例上調(diào)在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中有著極為重要的意義[15-16]。該研究顯示,與非LSCs比較,LSCs 亞群Bcl-2 的相對表達(dá)量增加,雖然Bax的表達(dá)在兩亞群細(xì)胞中差異無統(tǒng)計學(xué)意義,但是,LSCs 亞群Bcl-2/Bax 比值顯著升高。這一結(jié)果表明LSCs 比非LSCs 具有更強(qiáng)的凋亡逃逸現(xiàn)象,在臨床上表現(xiàn)為對誘導(dǎo)凋亡藥物不敏感,從而導(dǎo)致復(fù)發(fā)。

LSCs 不同于正常干細(xì)胞最顯著的一點(diǎn)是具有高致瘤性,作者建立模型后發(fā)現(xiàn):103的LSCs 早期(接種后3 周)即可在NOD/SCID 小鼠檢測到白血病細(xì)胞。而非LSCs組至少需要106個細(xì)胞才能成瘤,而且發(fā)病時間晚,這說明LSCs 亞群侵襲性更高,具有高致瘤性。

綜上所述,THP-1 細(xì)胞中存在小部分細(xì)胞,該部分細(xì)胞具有CD34+CD38-細(xì)胞免疫表型,處于靜止的周期狀態(tài),高表達(dá)耐藥基因和抗凋亡基因,具有干細(xì)胞的生物學(xué)特性及體內(nèi)致瘤性。

[1]王穎超,殷楚云,徐學(xué)聚,等.兒童急性淋巴細(xì)胞白血病128例免疫分型[J].鄭州大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版,2009,44(6):1238

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