尚平平，李 翔，聶 聰，趙 樂，孫學輝，彭 斌

中國煙草總公司鄭州煙草研究院煙草化學重點試驗室鄭州450001

#通訊作者，男，1972年10月生，博士，研究員，研究方向:煙草化學和煙草煙氣毒理學，E-mail:congnie@yahoo.com.cn

卷煙煙氣是由5 000 多種化合物組成的復雜氣溶膠，其中有69 種已經(jīng)確定為致癌物［1］，如B［a］P［2］、二甲基亞硝胺［3］、多環(huán)芳烴［4］等。國際煙草科學研究合作中心的煙草煙氣體外毒性測試工作組推薦采用中性紅細胞毒性試驗、體外微核試驗和鼠傷寒沙門氏菌/哺乳動物微粒體酶試驗(Ames 試驗)，對卷煙主流煙氣總粒相物(total particulate matter，TPM)進行一般毒性及遺傳毒性的毒理學評價。Ames 試驗是對受試化合物誘變作用的研究，由Ames［5］1966年建立并不斷改進完善，在加與不加S9活化系統(tǒng)情況下，檢測化合物對鼠傷寒沙門氏菌的誘變能力［6］。雖然國際煙草合作研究中心煙草煙氣體外毒性測試工作組對卷煙煙氣體外毒性評價給出了試驗項目選擇的建議，但各研究機構在進行具體試驗時采用的方法卻并不一致。作者對參比卷煙3R4F 進行Ames 試驗，從測試菌株選擇、S9濃度、預培養(yǎng)和預培養(yǎng)時間共4個方面進行探討，旨在為應用Ames 試驗評價卷煙主流煙氣TPM 遺傳毒性提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器 肯塔基3R4F 參比卷煙(肯塔基大學)，成年雄性SD 大鼠(河南省實驗動物中心提供，許可證號:SCXK(豫)2005-0001)，鼠傷寒沙門氏菌TA97、TA98、TA100 和TA102 菌株(軍事醫(yī)學科學院惠贈)。二甲基亞砜(DMSO，分析純，Amresco公司)，注射用多氯聯(lián)苯(美國Accustandard 公司)，疊氮鈉(Amresco 公司)，蒽胺(A Johnson Matthey 公司)，硝基芴(東京化成工業(yè)株式會社)，上層培養(yǎng)基瓊脂和底層培養(yǎng)基瓊脂(鄭州創(chuàng)生生物工程有限公司分裝)，組氨酸和生物素(日本Solarbio 公司)。RM20H 轉(zhuǎn)盤吸煙機(德國BORGWALDT 公司)，AL204-IC 電子分析天平(瑞士METTLER)，T25組織分散器(德國IKA 公司)，SW-CJ-2FD 超凈工作臺(蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司)，DK-S26恒溫水浴鍋(上海精宏試驗設備有限公司)，3-18K高速冷凍離心機(德國Sigma 公司)，Incucell222 生化培養(yǎng)箱(德國MMM 公司)，微量可調(diào)移液器(德國Eppendorf 公司)，全自動菌落計數(shù)儀(法國Interscience 公司)。

1.2 溶液配制

1.2.1 受試TPM 的配制 按GB/T5606.1 抽取卷煙作為試驗樣品，依據(jù)YC/T29-1996 標準規(guī)定的標準條件在RM20H 轉(zhuǎn)盤吸煙機上，抽吸20 支3R4F參比卷煙，收集劍橋濾片上的TPM，以DMSO 萃取至10 g/L，然后分別稀釋至250、500、750、1 000、1 250、2 500 和5 000 mg/L。染毒劑量分別為0、25、50、75、100、125、250 和500 μg/皿。

1.2.2 S9制備及S9混合液的配制 S9的制備:以玉米油為溶劑，配制200 g/L 的多氯聯(lián)苯，按500 mg/kg 的劑量無菌注射入大鼠腹腔。5 d 后處死大鼠，取肝臟，用冰冷0.15 mol/L 的KCl 清洗肝臟，而后加入0.15 mol/L 的KCl 溶液，勻漿后4℃低溫離心，分裝，于－80℃保存?zhèn)溆谩9經(jīng)無菌檢查、蛋白質(zhì)濃度測定(含量低于40 g/L)并經(jīng)間接致癌物(蒽胺)鑒定其生物活性合格。S9混合液的制備:參考加拿大衛(wèi)生部［7］《卷煙主流煙氣細菌回突變試驗》配制。其中每mL 體積分數(shù)10% S9混合液含:PBS 835 μL、1.65 mol/L KCl+0.4 mol/L MgCl2溶液20 μL、G-6-P 5 μL、NADP 40 μL 及S9100 μL;每mL 體積分數(shù)5% S9混合液含S950 μL，余與體積分數(shù)10% S9混合液同。

1.3 標準平板摻入試驗 參考加拿大衛(wèi)生部《卷煙主流煙氣細菌回突變試驗》［7］、OECD471《細菌回復突變試驗》［6］及GB 15193.4-2003［8］，制備底層平板和頂層培養(yǎng)基，進行標準平板摻入試驗。試驗包括加S9(+S9)和不加S9(－S9)活化系統(tǒng)兩部分，并設置自發(fā)突變組(受試物劑量為0)、溶劑(0.1 mL/皿DMSO)對照組和陽性對照組。在－S9活化系統(tǒng)時，TA97、TA100 和TA102 的陽性對照為10 mg/L疊氮鈉，TA98 的陽性對照為40 mg/L 硝基芴;+S9活化系統(tǒng)時，4 菌株的陽性對照為20 mg/L 蒽胺。4菌株過夜培養(yǎng)后，細菌數(shù)不少于(1～2)×109mL－1。在保持45℃恒溫的2.0 mL 頂層培養(yǎng)基中依次加入0.5 mmol/L組氨酸-生物素溶液0.2 mL、新鮮過夜培養(yǎng)的測試菌液0.1 mL、不同劑量的TPM 0.1 mL及體積分數(shù)10%S9混合液0.5 mL 后，低速旋轉(zhuǎn)3 s左右，傾倒于底層平板上，頂層培養(yǎng)基均勻分布于底層平板表面后，于37℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。計數(shù)各平板菌落數(shù)，空白對照組、溶劑對照組、陽性對照組及每個劑量組均設3 個平行皿，試驗重復3 次，取均值。以回突變菌落數(shù)為Y，TPM 劑量為X，得出劑量-反應關系的回歸方程。

1.4 不同濃度活化系統(tǒng)對回變菌落數(shù)的影響 以TA98 和TA100 為測試菌株，分別采用體積分數(shù)5%和10%2 種濃度的S9混合液，進行標準平板摻入試驗。劑量設置同1.3，計數(shù)各平板的回突變菌落數(shù)，并求得劑量-反應關系的回歸方程。溶劑組的回突變菌落數(shù)均未超過自發(fā)回突變數(shù)的2 倍，說明所選溶劑無致突變作用，對試驗結果無干擾;劑量組回突變菌落數(shù)超過自發(fā)回突變數(shù)2 倍，并有劑量-反應關系的，可認為受試TPM 有致突變作用［7］。

1.5 不同預培養(yǎng)時間對回突變菌落數(shù)的影響 以TA98 和TA100 為測試菌株，將0.1 mL 新鮮菌液、0.1 mL 受試TPM 溶液(溶劑對照加0.1 mL DMSO)和0.5 mL S9混合液移入預冷的帶蓋帽無菌培養(yǎng)管內(nèi)，混勻后，在37℃下預培養(yǎng)0、20、40 和60 min，加入頂層培養(yǎng)基，混勻傾倒于底層平板，于37℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h 后，計數(shù)各組平板的回突變菌落數(shù)。

1.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0 進行處理，采用t 檢驗比較不同處理方法下劑量-反應關系回歸系數(shù)的差異，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 TPM 對沙門氏菌的致突變能力 TA98 和TA100 在S9存在時的陽性回突變情況見圖1。不同劑量TPM 對沙門氏4 菌株誘發(fā)的回突變菌落數(shù)見表1。TPM 在1 000 mg/L 時，在+S9的情況下，回突變菌落數(shù)為自發(fā)突變數(shù)的2 倍以上，而且在試驗劑量范圍內(nèi)顯示有劑量-反應關系，說明卷煙主流煙氣TPM對TA98 顯示有致突變作用;無論S9活化系統(tǒng)存在與否，TPM 對其他3 種菌株均無致突變作用，表明TA98對卷煙主流煙氣TPM 較為敏感。4 菌株的診斷性誘變劑(陽性對照)均顯示陽性反應，說明S9及試驗操作可靠。對TA100 和TA102 在+S9情況下的劑量-反應關系進行線性回歸分析，回歸方程分別為^Y =147.60 +0.18X 和^Y =269.81 +0.12X，回歸系數(shù)經(jīng)t 檢驗分析后，t =2.180，P =0.047，表明TA100 與TA102 的劑量-反應關系差異有統(tǒng)計學意義，同時TA100 的回歸系數(shù)大于TA102 的回歸系數(shù)，表明在劑量范圍內(nèi)TA100 比TA102 的回突變能力強。

2.2 不同濃度S9混合液的活化能力比較 37℃培養(yǎng)48 h 后，TPM 各劑量組的測試菌株菌苔背景良好。由表2可知，不同濃度S9作用，TPM 均對TA98顯示有致突變作用。經(jīng)t 檢驗分析后，體積分數(shù)分別為5%和10% S9活化系統(tǒng)下，TA98 和TA100 的劑量-反應關系回歸系數(shù)差異無統(tǒng)計學意義，說明TA98 和TA100 在5%和10% S9活化系統(tǒng)下的劑量-反應關系無差異。

2.3 不同預培養(yǎng)時間對回變菌落數(shù)的影響 對TPM 進行不同預培養(yǎng)時間的Ames 試驗后，結果見表3、4。20、40 和60 min 預培養(yǎng)時間下劑量-反應關系的回歸系數(shù)與未預培養(yǎng)差異均無統(tǒng)計學意義。而預培養(yǎng)20 min 的TPM 在劑量為75 μg/皿時，已顯示有對TA98 的致突變作用，而且對于TA98 和TA100，僅有預培養(yǎng)20 min 時的劑量-反應關系回歸系數(shù)的數(shù)值大于未預培養(yǎng)。

表1 不同劑量TPM 對沙門氏4 種菌株誘發(fā)的回突變菌落數(shù)(n=3)個/皿

表2 不同濃度S9 作用后TPM 對TA98 和TA100 致突變情況(n=3)個/皿

表3 不同預培養(yǎng)時間下TPM 對TA98 的致突變情況(n=3)個/皿

表4 不同預培養(yǎng)時間下TPM 對TA100 的致突變情況(n=3)個/皿

3 討論

卷煙主流煙氣中含有B［a］P、4-氨基聯(lián)苯、多環(huán)芳烴等多種改變機體遺傳物質(zhì)的有害成分，而這些有害成分之間可能存在相互作用，因此研究單一有害成分的毒性作用是不具有代表性的。該研究采用3R4F 參比卷煙主流煙氣的TPM 作為受試物，通過Ames 試驗來判斷卷煙煙氣的致基因突變能力。Ames 試驗從核酸水平研究化學物的毒性作用，具有快速、有效、經(jīng)濟的特點，其敏感度和特異度為80%～90%［9］，是目前國際上普遍采用的檢測環(huán)境中大量潛在致癌物通用的初篩方法之一［10］。

TA97 和TA98 可檢出移碼突變，TA100 和TA102 可檢出堿基置換和移碼突變［7］。該試驗結果顯示，在S9存在下，TA98 和TA100 兩種菌株對TPM相對比較敏感，與1995年Steele 等［11］的報道一致，并且TA98 和TA100 的組合同樣能檢測出移碼突變和堿基置換，因此，在研究卷煙煙氣TPM 的致突變能力時，可采用這兩種菌株進行。由于不同誘變劑所需S9的濃度不同，在進行Ames 試驗時，每平板S9的含量直接關系到誘變劑的最佳誘變作用，作者采用體積分數(shù)5%和10%兩種S9濃度進行活化作用比較。結果表明兩者的活化效果基本一致，因此S9濃度選擇以5%為佳，可以在保證試驗結果有效的前提下，使Ames 試驗更為簡便、省時和節(jié)約。

卷煙煙氣是含有大量化合物的復雜氣溶膠，其中的化合物的毒性作用千差萬別，該試驗在標準平板摻入法的基礎上增加了預培養(yǎng)階段。結果發(fā)現(xiàn)37℃預培養(yǎng)20 min 后，回突變菌落數(shù)普遍增加，這是由于較高溫度下孵育TPM、細菌和S9，可能提高了TPM 中某些遺傳毒性物質(zhì)敏感性。同時，隨著預培養(yǎng)時間的增加，回突變菌落數(shù)增長相對緩慢，可能由于長時間的孵育，引起S9的活性降低，或是長時間接觸較高濃度的TPM 出現(xiàn)抑菌現(xiàn)象，從而影響了TPM 對細菌的致突變作用。

該試驗通過比較Ames 試驗的不同影響因素，結果發(fā)現(xiàn)以TA98 和TA100 為測試菌株，體積分數(shù)為5%的S9活化系統(tǒng)，預培養(yǎng)20 min 可以有效檢測3R4F 參比卷煙主流煙氣TPM 的誘變作用。

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