李時(shí)光 陳江波 李 靜

1）鄭州市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科五病區(qū) 鄭州 450000 2）新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院神內(nèi)一科 新鄉(xiāng) 453000

急性一氧化碳（CO）中毒可造成以中樞神經(jīng)系統(tǒng)及心血管系統(tǒng)功能損害為主的全身各組織細(xì)胞的損傷［1］。部分急性一氧化碳（CO）中毒患者經(jīng)治療神志清醒后，經(jīng)過(guò)3～60d表現(xiàn)正?；蚪咏５募儆?，會(huì)出現(xiàn)急性一氧化碳中毒后遲發(fā)性腦病（DEACMP），出現(xiàn)以癡呆、精神失常和錐體外系癥狀為主要表現(xiàn)的一組神經(jīng)精神癥狀。

目前，甄龍等［2-3］研究發(fā)現(xiàn)，血清水平免疫因子參與DEACMP的發(fā)病，證實(shí)DEACMP可能是由于急性一氧化碳中毒誘發(fā)腦神經(jīng)免疫損傷所致。但年齡、性別類似且中毒程度相同的患者發(fā)生幾率又有很大差別，提示存在個(gè)體間的差異，推測(cè)個(gè)體遺傳因素可能起到了重要作用。

DEACMP 的病理改變-腦白質(zhì)廣泛的脫髓鞘及腦萎縮特點(diǎn)［4］均與多發(fā)性硬化（MS）類似，兩者同屬于獲得性中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病，在腦部病理?yè)p傷中有著許多共同之處。目前DEACMP 的基因研究未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，關(guān)于MS易感基因多態(tài)性研究多集中在免疫相關(guān)基因、髓鞘結(jié)構(gòu)基因等方面。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)MS全基因組關(guān)聯(lián)研究等相關(guān)文獻(xiàn)［5-6］的檢索和比較，選用TNF-α基因308位點(diǎn)，研究其基因多態(tài)性與DEACMP的遺傳易感性之間的關(guān)系。

1 資料和方法

1.1 一般資料 DEACMP組109例，男55例，女54例；年齡42～89 歲，平均（59.68±9.72）歲。文化程度：文盲32例，小學(xué)41例，中學(xué)以上36例。急性CO 中毒時(shí)均有昏迷史，昏迷持續(xù)時(shí)間2～72h，平均（16.09±15.13）h。間歇期（急性一氧化碳中毒昏迷清醒后到出現(xiàn)遲發(fā)腦病癥狀之間的時(shí)間間隔）7～45d，平均（20.27±9.43）d。急性CO 中毒組115例，男50 例，女65 例；年齡40～84 歲，平 均（56.12±7.38）歲。文化程度：文盲34 例，小學(xué)39 例，中學(xué)以上42例。急性CO 中毒時(shí)均有昏迷史，昏迷持續(xù)時(shí)間1～51h，平均（6.78±7.49）h。對(duì)所有患者均進(jìn)行90d以上的隨訪，均未發(fā)生DEACMP。2組均為豫北地區(qū)漢族患者，均取得患者或其家屬知情同意。2組間年齡、性別及文化程度均組間匹配。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采 集：DEACMP 組 患 者 均 于 晨6～8 時(shí)，急 性CO 中毒組患者于搶救成功完全清醒后2h內(nèi)，采集空腹肘靜脈5mL EDTA 抗凝血，置于-70℃低溫冰箱中保存。應(yīng)用TIANGEN 公司血液基因組DNA 提取試劑盒提取DNA。

1.2.2 檢 測(cè) 方 法：TNF-α308 基 因 多 態(tài) 性分 析：參 照 呂 兆琴［7］、Tarkowski等［8］的實(shí)驗(yàn)方法，設(shè)計(jì)擴(kuò)增TNF-α308啟動(dòng)子區(qū)域的上游引物序列為T(mén)NF1 5′-AGGCAATAGGTTTTGAGGGCCATG-3′和 下 游 引 物 序 列 為T(mén)NF2 5′-ACACACAAGCATCAAGGATACC-3′（由大連TaKaRa生物工程有限公司合成）。擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為143bp。PCR 體系總體積為25μL，其中包括EmeraldAmpTM PCR Master Mix（PCR 反應(yīng)用各種酶、Buffer、dNTP混合物等試劑的2倍濃度預(yù)混型制品）12.5μL、DNA 模板5μL、上游和下游引物（10μmol／L）各1μL、滅菌蒸餾水（dH2O）5.5μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋孩?5℃預(yù)變性5min；②熱循環(huán)：95℃30s，58.8℃50s，72℃90 s，共30個(gè)循環(huán)；③延伸：72℃5min。酶切體系總體積為10 μL，含有：3μl PCR 擴(kuò) 增 產(chǎn) 物，內(nèi) 切 酶StyI（10μg／μL）0.5 μL，RE 10× Buffer 1μL，Acetylated BSA（10μg／μL）0.1 μL，滅菌雙蒸水5.4μL。體系充分混勻后在37℃恒溫水浴1.5h，72℃水浴10min終止消化。2.0%瓊脂糖凝膠電泳分離，BTS-20 M 型凝膠成像分析系統(tǒng)攝像并保存。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 13.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理?；蛐头植碱l率的Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)采用擬合優(yōu)度卡方檢驗(yàn)。TNF-α308 基因型、等位基因計(jì)數(shù)用直接計(jì)數(shù)法，并計(jì)算基因型及等位基因頻率，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。

表1 2組各基因型Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)

表2 2組各基因型分布和等位基因頻率的比較 ［n（%）］

表3 2組女性患者各基因型分布和等位基因頻率的比較 ［n（%）］

表4 2組男性患者各基因型分布和等位基因頻率的比較 ［n（%）］

2 結(jié)果

從表1可以看出2組各基因型Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均＞0.05），說(shuō)明2組樣本有群體代表性。2組間TNF-α308基因型分布及等位基因頻率的比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均＞0.05）。（見(jiàn)表2）。按性別分層后，2組間TNF-α308各基因型和等位基因頻率比較（見(jiàn)表3、表4）。差異仍無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均＞0.05）。

3 討論

人TNF基因位于6 號(hào)染色體主要組織相容性復(fù)合體（MHC）區(qū)內(nèi)的7kb區(qū)，其編碼產(chǎn)物是具有廣泛生物學(xué)活性的多態(tài)調(diào)節(jié)因子TNF-α和TNF-β。研究發(fā)現(xiàn)TNF 基因多態(tài)性現(xiàn)象的標(biāo)志是其基因內(nèi)的堿基變化，TNF-α基因的多態(tài)性位點(diǎn)主要集中在其啟動(dòng)子區(qū)域，此區(qū)域多個(gè)位點(diǎn)具有多態(tài)性。Kroeger與Gonzalez等［9-10］對(duì)TNF-α308位點(diǎn)G／A 多態(tài)性對(duì)TNF-α轉(zhuǎn)錄的影響進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)G 等位基因突變?yōu)锳 后，TNF-α基因轉(zhuǎn)錄效率明顯增加，提示TNF-α308位點(diǎn)A 等位基因可能通過(guò)促進(jìn)TNF-α基因轉(zhuǎn)錄，提高血中TNF-α含量，從而影響對(duì)疾病的易感性。國(guó)內(nèi)蒲杰［11］、Lu［12］等研究也發(fā)現(xiàn)TNF-α308基 因 型（包 括GA 和AA 型）可以提高TNF-α啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性而增加TNF-α的轉(zhuǎn)錄合成，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生。

本實(shí)驗(yàn)研究了啟動(dòng)子區(qū)域TNF-α308 位點(diǎn)基因型頻率及等位基因頻率在豫北漢族DEACMP組和急性CO 中毒組（對(duì)照組）患者中的分布，2組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。按性別分層后，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

盡管在DEACMP發(fā)病過(guò)程中存在免疫介質(zhì)TNF-α表達(dá)異常，但本實(shí)驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)TNF-α308基因多態(tài)性與DEACMP關(guān)聯(lián)，考慮原因如下：（1）樣本大小和種族差異的問(wèn)題，由于TNF-α308A 等位基因在漢族人群中分布較少，樣本量過(guò)少會(huì)導(dǎo)致GA、AA 基因型頻度顯著下降，導(dǎo)致統(tǒng)計(jì)結(jié)果無(wú)差異性；（2）TNF 基因位于HLA-Ⅲ類基因區(qū)內(nèi)，與某些HLA 單倍型存在鏈鎖不平衡，而這些單倍型亦可能與TNF 基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)有關(guān)，并且可能起主導(dǎo)作用，而TNF 基因起輔助或協(xié)同作用。

總之，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果雖未發(fā)現(xiàn)TNF-α308 基因多態(tài)性與DEACMP遺傳易感性之間存在關(guān)聯(lián)，但擴(kuò)大樣本量，進(jìn)行更深入的研究，有望獲得更有價(jià)值的發(fā)現(xiàn)。

［1］葉任高，陸再英.內(nèi)科學(xué)［M］.6版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2004：971-974.

［2］甄龍，顧仁駿，張萍，等.急性一氧化碳中毒后遲發(fā)性腦病患者血清白細(xì)胞介素-1β、8、10的水平及其臨床意義［J］.中華勞動(dòng)衛(wèi)生職業(yè)病雜志，2008，26（9）：651-652.

［3］張萍，顧仁駿，張帆.急性一氧化碳中毒后遲發(fā)性腦病患者血清白細(xì)胞介素水平的變化及其臨床意義［J］.臨床神經(jīng)病學(xué)雜志，2007，20（3）：220-221.

［4］李文武，急性一氧化碳中毒后遲發(fā)性腦病27例臨床分析［J］.中國(guó)實(shí)用神經(jīng)疾病雜志，2011，14（7）：57-58.

［5］Hafler DA，Compston A，Sawcer S，et al.Risk alleles for multiple sclerosis identified by agenomewide study［J］.N Engl J Med，2007，357（9）：851-862.

［6］Sarial S，Shokrgozar MA，Amirzargar A，et al.IL-1，IL-1Rand TNFalpha gene polymorphisms in Iranian patients with multiple sclerosis［J］.Iran J Allergy Asthma Immunol，2008，7（1）：37-40.

［7］呂兆琴，孫斌.腫瘤壞死因子-α基因多態(tài)性與Graves眼病的相關(guān)性研究［J］.山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，39（7）：633-636.

［8］Tarkowski E，Liljeroth AM，Nilsson A，et al.TNF gene polymorphism and its relation to intracerebral production of TNFα and TNFβin AD［J］.Neurology，2000，54（11）：2 077-2 081.

［9］Kroeger K M，Steer J H，Joyce D A，et al.Effects of stimulus and cell type on the expression of the-308tumour necrosis factor promoter polymorphism［J］.Cytokine，2000，12（2）：110-119.

［10］González S，Rodrigo L，Martínez-Borra J，et al.TNF-alpha-308A promoter polymorphism is associated with enhanced TNF-alpha production and inflammatory activity in Crohn’s patients with fistulizing disease［J］.Am J Gastroenterology，2003，98（5）：1 101-1 106.

［11］蒲杰，曾蔚越.早產(chǎn)患者TNF-α基因啟動(dòng)子-308位點(diǎn)多態(tài)性與胎盤(pán)TNF-αmRNA、母血TNF-α表達(dá)關(guān)系的研究［J］.四川大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2009，40（1）：77-80

［12］Lu MC，Yang KL，Tung CH，et al.Higher LPS-stimulated TNF-alpha mRNA levels in peripheral blood mononuclear cells from Chinese ankylosing spondylitis patients with-308G／A polymorphism in promoter region of tumor necrosis factor：association with distinct A33／B58／Cw10 haplotypes［J］.Rheumatol Int，2008，29（2）：189-195.