林曾歡林碧芬黃志堅(jiān)

（1.福清市畜牧獸醫(yī)中心 福建福清 350300；2.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所 福州 350013；3.福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院 福州 350002）

蟛蜞菊（Wedelia chinensis），為菊科(compositae)蟛蜞菊屬(wede1ia)植物，多年生草本，《中藥大辭典》記載：清熱、解毒、祛癖、消腫，主治白喉、百日咳、痢疾、痔瘡、跌打損傷［1］。蟛蜞菊已作為草藥在中國南方民間被廣泛應(yīng)用，特別在福建和廣東地區(qū)。其不僅資源豐富，且富含萜類、生物堿、黃酮類物質(zhì)等多種生物活性成分，具有顯著的抗炎、止咳、抑菌、保肝療效，安全方便，是一種良好的中草藥資源［2-4］。

隨著我國畜禽養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，畜禽致病菌多重感染、抗生素長期大量使用帶來的畜禽產(chǎn)品安全問題日益突出，如腸道菌群失衡、毒副作用、耐藥性及其傳遞轉(zhuǎn)移等負(fù)效應(yīng)。因此，探索與研制抗菌活性高、毒性低、殘留少的廣譜飼料抗生素替代品，以提高細(xì)菌多重感染性疾病的控制水平和畜禽產(chǎn)品的質(zhì)量安全已成為21世紀(jì)健康養(yǎng)殖的重要課題。

研究證明，揮發(fā)油(essentia1oi1)的活性成分具有較強(qiáng)的表面活性和脂溶性，能迅速穿透病原微生物的細(xì)胞膜，使其內(nèi)容物流失，并能有效阻止線粒體內(nèi)的呼吸氧化過程，使病原微生物喪失能量供應(yīng)而死亡［5］。目前，揮發(fā)油也已作為飼料添加劑被應(yīng)用于畜牧生產(chǎn)中，圍繞各種揮發(fā)油進(jìn)行的試驗(yàn)也成為了當(dāng)前飼料添加劑研究的熱點(diǎn)之一［6-7］，但有關(guān)蟛蜞菊揮發(fā)油作為抗生素替代品應(yīng)用于飼料中的研究較少。本研究以4種病原菌為對(duì)象，研究了蟛蜞菊揮發(fā)油的抑菌效果，為其作為飼料抗生素替代品的開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 植物原材料 蟛蜞菊地上部分采自福建農(nóng)林大學(xué)。

1.1.2 供試菌種 大腸桿菌（Escherichia coli）；金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）；葡萄球菌（Staphylococcus sp.）；沙門氏菌（Salmonella sp.）購于中國藥品生物制品檢定所。

1.1.3 主要試驗(yàn)設(shè)備和藥品 揮發(fā)油水蒸汽提取裝置，正茂玻璃儀器廠；LRH-150生化培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺(tái)（潔凈度100級(jí)），蘇州凈化設(shè)備有限公司；LDZX-30KBS型立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；TGL-16G臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，上海安亭科技儀器廠；JEM—1010型透射電電子顯微鏡，日本電子株式會(huì)社。乙醚、95%乙醇、氯化鈉、硫酸鈉等均為分析純。

1.1.4 培養(yǎng)基配制 肉湯培養(yǎng)基：肉湯培養(yǎng)基1.1 g，50 mL蒸餾水，121℃滅菌30 min備用；瓊脂培養(yǎng)基：瓊脂培養(yǎng)基4.5 g，100 mL蒸餾水，121℃滅菌30 min備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 蟛蜞菊揮發(fā)油的提取 準(zhǔn)確稱取2 000.0 g新鮮蟛蜞菊地上部分，切成1～2 cm碎片，置于揮發(fā)油水蒸汽提取裝置中，按水蒸汽蒸餾法進(jìn)行蒸餾4 h，收集揮發(fā)油，經(jīng)NaC1飽和后用乙醚萃取3次，萃取液用無水硫酸鈉干燥，過夜，蒸餾回收乙醚后冷藏備用。

1.2.2 抑菌活性的測(cè)定

1)抑菌原液樣品制備。取蟛蜞菊揮發(fā)油，用95%乙醇溶解稀釋成含揮發(fā)油50 mg/mL的藥液，濾菌備用。

2)抑菌圈測(cè)定（濾紙片擴(kuò)散法）。將直徑為6 mm的圓濾紙片經(jīng)高壓滅菌后在50 mg/mL的揮發(fā)油藥液中浸漬10 min備用。將濃度為105CFU/mL的各試驗(yàn)菌懸液0.2 mL在相應(yīng)的固體培養(yǎng)基上均勻涂布，制成含菌平板。取浸漬過的濾紙片貼于不同的含菌平皿上，用稀釋10-4倍的慶大霉素作陽性對(duì)照，用95%乙醇作陰性對(duì)照，將各培養(yǎng)皿置于37℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后。精確量取抑菌圈直徑，結(jié)果取4次重復(fù)試驗(yàn)的平均值。

3)最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌溶度（MBC）測(cè)定。將蟛蜞菊揮發(fā)油加到2 mL 1.0×105CFU/mL各試驗(yàn)菌懸液中，使揮發(fā)油最終稀釋濃度為70、60、50、40、30 mg/mL，同時(shí)設(shè)細(xì)菌對(duì)照組和空白對(duì)照組，置于37℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果，以無菌生長的最低濃作為該供試菌種的最小抑菌濃度。

從MIC試驗(yàn)無菌生長的試管中吸取0.05 mL液體加入到0.15 mL肉湯培養(yǎng)基中混和均勻（通過稀釋法解除殘留藥物的抑菌作用），吸取0.1 mL到固體培養(yǎng)基中涂布均勻。將培養(yǎng)皿正面向上放入37℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約0.5 h后，待表面干燥將培養(yǎng)皿倒扣繼續(xù)培養(yǎng)至24 h，以完全無菌生長的最低濃度作為該供試菌種的最低殺菌濃度。

2 結(jié)果與分析

由表1可知，蟛蜞菊揮發(fā)油對(duì)4種供試細(xì)菌都有較好的抑制作用，表現(xiàn)出良好的廣譜抗菌效果，其中以對(duì)大腸桿菌的抑制作用最強(qiáng)。結(jié)果顯示，蟛蜞菊揮發(fā)油對(duì)沙門氏菌的最小抑菌濃度為40 mg/mL，其他的則為50 mg/mL。根據(jù)文獻(xiàn)（劉洋等，2009），蟛蜞菊揮發(fā)油對(duì)供試菌種的MIC都介于7.81～250 g/L，為中度敏感。

表1 蟛蜞菊揮發(fā)油對(duì)7種供試菌的抑菌圈和MIC、MBC

3 討論

蟛蜞菊揮發(fā)油對(duì)常見的畜禽病原菌如大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、葡萄球菌和沙門氏菌都具有良好的抑制效果，顯示出廣譜的抗菌效果。雖然與抗生素相比，蟛蜞菊揮發(fā)油的抑菌效果較差，但是抗生素在畜牧養(yǎng)殖生產(chǎn)中濫用造成的藥物殘留不僅嚴(yán)重影響畜產(chǎn)品的質(zhì)量，且導(dǎo)致多重耐藥與交叉耐藥性，更嚴(yán)重威脅著人類的健康。而植物本身所具有的低毒、低殘留、低耐藥性等特性是抗生素所不具備的。因此，研究開發(fā)蟛蜞菊揮發(fā)油作為飼料添加劑具有一定的生產(chǎn)意義，但是其具體抗菌成分和抗菌機(jī)制尚未明確，需要進(jìn)一步深入研究。

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［2］宋立人，洪恂，丁緒亮，等.現(xiàn)代中藥學(xué)大辭典(上冊(cè))［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2001:2456-2457.

［3］ 謝宗萬.漢拉英對(duì)照中藥材正名詞典［M］.北京:北京科學(xué)技術(shù)出版社，2004:766.

［4］ 梁方方，莫毅，賴志強(qiáng)，等.蟛蜞菊對(duì)小白鼠的急性毒性試驗(yàn)［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2009，36(3):223-225.

［5］ 姚新生.天然藥物化學(xué)［M］.3版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2002:245-246.

［6］ Hayashi K，Imanishi N，Kashiwayama Y.Inhibitory effect of cinnama1dehyde，derived from Cinnamomi cortex，on the growth of inf1uenza A/PR/8 virus in vitro and in vivo［J］.Antivira1Research，2007，74:1-8.

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