洪志勇李玉芳，2李 明張興峰林秀嬌李鴻翔莊益芬張文昌*

（1.福建農(nóng)林大學動物科學學院 福州 350002；2.黃淮學院 河南駐馬店 463000）

鵪鶉屬于鳥類，是高等脊椎動物，與其他動物相比，以轉基因技術為依托的禽類生物反應器有著巨大的經(jīng)濟效益。然而，鵪鶉在長期的生物進化中，形成了自己獨特的生理結構與生活習性，尤其是其獨特的生殖解剖和生殖生理特點，完全不同于哺乳動物的特殊生殖模式，使得現(xiàn)有的應用于哺乳動物的基因轉移方法不能完全套用，須在深入了解禽類具體的生理特點的基礎上，結合哺乳動物基因轉移策略進行創(chuàng)新和改進。

制備轉基因鵪鶉，通過對轉基因鵪鶉蛋中的蛋清蛋白進行分析，是檢測構建的表達載體有效與否的最準確的方法，但是轉基因鵪鶉的制備需要耗費大量的人力、物力，并且試驗周期長，步驟繁瑣，在試驗過程中，不同的轉基因個體也存在著很大差異，也會對表達的結果造成許多偏差。通過細胞培養(yǎng)技術可以彌補以上不足，首先對輸卵管上皮細胞進行體外培養(yǎng)，然后利用脂質體介導轉染技術將外源基因導入細胞內(nèi)，通過檢測外源基因在輸卵管上皮細胞上的表達來驗證表達載體構建及目的基因表達的正確性。相對于轉基因的個體而言，該方法簡單，結果明確，試驗周期短，常用于制備轉基因動物前對載體各元件功能的檢測和篩選。

Ochiai等［1-2］將 1.35 kb 的卵清蛋白基因 5’調控區(qū)調控的人促紅細胞生成素(EPO)基因通過電穿孔法導入原代輸卵管上皮細胞，探討了hEPO基因轉錄的可能性；接著又用電脈沖法導入活雞的輸卵管上皮細胞，證明了hEPO在輸卵管內(nèi)表達的可能性。宇麗等［3］把1.1 kb的卵清蛋白5’端調控區(qū)調控的CAT基因通過脂質體技術，轉染雞原代輸卵管上皮細胞和雞成纖維細胞，結果在雞原代輸卵管上皮細胞轉染48 h后表達量最高；而在雞成纖維細胞，不論有無類固醇存在，均不表達。結果說明，在輸卵管細胞中存在細胞特異性轉錄因子。

20世紀60年代Banghan發(fā)明了脂質體，Robert在80年代初將脂質體用于質粒的包裹，1987年美國生命技術公司推出了合成的脂質體試劑，使之廣泛應用于動物細胞的轉染。脂質體介導的方法具有可重復、持續(xù)、高效、易操作，對細胞毒害作用小，不受外源基因大小及細胞種類(指動物細胞)的限制，體內(nèi)外都有較高的轉染效率等優(yōu)點［4-6］，在轉基因動物的制備研究中深受歡迎，應用越來越廣泛，尤其是近幾年發(fā)展得更快，己成為動物細胞轉染的常規(guī)方法。但該方法尚存在穩(wěn)定性及核酸包裹率等問題也不能用于帶壁細胞，仍需進一步完善。

試驗選擇培養(yǎng)2種細胞對構建的載體進行檢測，篩選出陽性細胞，目的是通過將構建的人血清白蛋白表達載體在這兩種鵪鶉自身的細胞中進行轉染，然后提取基因組DNA用PCR方法和SDSPAGE方法來對構建的蛋白表達載體的有效性進行檢測和篩選。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞和質粒 日本鵪鶉及幼雛由本研究室飼養(yǎng)和孵化；人血清白蛋白基因真核熒光表達載體：pEGFP-VH。

1.1.2 主要試劑 質粒提取試劑盒購自上海生物工程公司；胎牛血清、DMEM-F12培養(yǎng)液均購自廈門泰京生物公司；Lipofectin TM Reagent購自Introgen公司；雌二醇、皮質酮、胰島素均購自華美公司。

1.2 方法

1.2.1 質粒pEGFP-VH的純化 從37℃培養(yǎng)16～20 h的新鮮培養(yǎng)板中挑取1個大腸桿菌單菌落，轉到含有100 mL LB培養(yǎng)基的錐形瓶中，37℃振蕩培養(yǎng)16～24 h，提取質粒并純化。

1.2.2 鵪鶉輸卵管上皮細胞的原代培養(yǎng) 取4日齡鵪鶉幼雛，連續(xù)10 d飼喂15 mg乙烯雌酚（DES），然后撤掉DES，1周后改為連續(xù)15 d飼喂25 mgDES，在幼雛處死之前48 h撤掉DES。處死幼雛，取輸卵管膨大部分，剪成 1～2 mm 碎塊（凈重 0.5～1 g），在40 mL 解離液(F12)中孵育 30 min。放置 2～3 min，去除上清液。其余部分加入新鮮的解離液，繼續(xù)孵育30 min。靜置2～3 min后，將上清液移入50 mL離心管中，加入胎牛血清，離心5 min，清洗沉淀2次。最后將細胞重新懸浮在無血清DMEM-F12（1：1）混合培養(yǎng)液中（含抗生素和0.1%BSA），以1×106ce11/孔接種到24孔培養(yǎng)板，立即轉染。

1.2.3 鵪鶉成纖維細胞的培養(yǎng)

1)胚胎的采取。取10日齡鵪鶉胚胎，氣室端用5%碘酒消毒，敲開一小口，用鑷子將胚胎取出，置于無菌平皿內(nèi)（事先放入PBS液）。去頭、內(nèi)臟和四肢。

2)成纖維細胞的分離。用Hanks去除血細胞、色素物質及細胞碎片后，移入鏈霉素小瓶內(nèi)，剪成1～2 mm碎塊。再用PBS液洗2～3次。加入500μL 0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA混勻后，37℃消化10 min，過濾，將上清液離心(600 r/min、10 min)，棄上清液，再用DMEM-F12培養(yǎng)液懸浮沉淀，過濾，移至另一離心管中，離心(1 500 r/min、5 min)，培養(yǎng)液洗滌細胞2次，取沉淀物加營養(yǎng)液(含3%小牛血清)，于細胞計數(shù)板上計數(shù)。

3)成纖維細胞的培養(yǎng)。將成纖維細胞稀釋成5×105/mL左右放入100 mL培養(yǎng)瓶中，加入10 mL培養(yǎng)液，放入37℃、5%CO2、濕度75%的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后倒掉營養(yǎng)液，用PBS洗2次，去除雜質細胞，每24 h更換營養(yǎng)液。待細胞鋪滿瓶底時倒棄營養(yǎng)液，再用PBS溶液洗滌細胞，加入1 mL消化液，室溫消化1 min，在顯微鏡下觀察到梭形細胞纖維消失、大部分細胞收縮成圓球形時，加入2 mL含15%FBS的培養(yǎng)液，混勻，終止消化。將消化后的細胞懸液轉至離心管中，3 000 r/min離心5 min后棄上清，加入DMEM-F12培養(yǎng)液，離心洗滌2次后，加1 mL營養(yǎng)液混勻，顯微鏡下用細胞計數(shù)器計數(shù)，放入37℃、5%CO2、濕度75%的二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.4 轉染 制備DNA-Lipofectamine（即 DNA-脂質體）混合物（30 min內(nèi)完成），并設計轉染HAS基因的試驗組、對照組和轉染空質粒的輸卵管上皮細胞組。將轉染后細胞放到50 mL離心管中離心5 min。再以DMEM-F12懸浮細胞，離心棄上清液。加入含有10%胎牛血清的F12培養(yǎng)液、10-7mo1/L雌二醇、10-6mo1/L皮質酮、40 ug/L胰島素，加培養(yǎng)液至3 mL，37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)。

1.2.5 觀察與檢測 轉化的細胞用熒光顯微鏡觀察，收集細胞及上清液，檢測轉染水平。每隔12 h將其置于倒置熒光顯微鏡上觀察pEGFP-VH質粒在鵪鶉原代輸卵管上皮細胞和鵪鶉成纖維細胞中綠色熒光蛋白的表達。待轉染72 h收集細胞上清液。

1.2.6 轉染細胞外源基因表達的初步檢測 穩(wěn)定轉染鵪鶉輸卵管上皮細胞采用PCR檢測和HSA蛋白表達檢測。

2 結果與分析

2.1 鵪鶉輸卵管上皮細胞的培養(yǎng)及其轉染結果

試驗獲得的鵪鶉輸卵管上皮細胞培養(yǎng)16 h時，細胞開始貼壁；48 h后細胞增多，貼壁上皮細胞蔓延生長，呈圓形或條狀；72 h后細胞增長緩慢，體積變大，少數(shù)細胞脫落死亡。見圖1-圖2。

圖1 原代培養(yǎng)的鵪鶉輸卵管上皮細胞

圖2 HSA真核表達載體在鵪鶉原代輸卵管上皮細胞中的表達

2.2 鵪鶉成纖維細胞的培養(yǎng)及轉染結果 試驗分離的鵪鶉成纖維細胞及其細胞核均呈圓形或橢圓形，細胞前期貼壁生長良好，呈梭形（傳代后1 d），生長速度快，DMEM-F12培養(yǎng)液（含10%FBS）能很好地維持其生長需要，接種后2 h左右開始貼壁生長，2～3 d即可鋪滿瓶底，經(jīng)過3～5次傳代后，生長速度明顯變慢，體積成不規(guī)則狀，見圖3。pEGFPVH在鵪鶉胚胎成纖維細胞中48 h時未見綠色熒光表達。

圖3 鵪鶉胚胎成纖維細胞

2.3 轉染細胞外源基因表達的初步檢測 提取轉染的、未轉染的和轉染空質粒的輸卵管上皮細胞基因組DNA，PCR檢測顯示僅在轉染組擴增獲得約1 900 bp的片段，而對照組無此條帶，說明HSA基因已經(jīng)穩(wěn)定整合到輸卵管上皮細胞基因組中（見圖4）。

圖4 轉染的陽性細胞PCR檢測結果

2.4 HSA表達檢測結果 在分泌表達載體轉染鵪鶉輸卵管上皮細胞和成纖維細胞培養(yǎng)72 h后收集細胞上清液，用鹽析方法沉淀蛋白，透析、濃縮，最后進行SDS-PAGE電泳檢測蛋白成分。結果顯示，僅在轉染HSA基因的鵪鶉輸卵管上皮細胞培養(yǎng)液上清中出現(xiàn)了分子量約68 kDa的蛋白條帶，而在未轉染的和轉染空質粒的鵪鶉輸卵管上皮細胞的培養(yǎng)液上清中未見目的蛋白條帶，結果見圖4-圖5。

圖5 HSA蛋白的SDS-PAGE結果(銀染色)

3 討論

本試驗通過脂質體陽離子介導方法將HAS基因導入到鵪鶉輸卵管上皮細胞成纖維細胞，在培養(yǎng)48 h后熒光顯示。輸卵管生物反應器的研究是從輸卵管上皮細胞的培養(yǎng)以及在培養(yǎng)的輸卵管細胞內(nèi)和在活雞的輸卵管內(nèi)研究外源基因的表達開始的。1967年Ma11ey等首先進行了雞輸卵管組織的培養(yǎng)，雖然輸卵管能貼壁成單層的細胞，但生長緩慢。最初培養(yǎng)輸卵管細胞的目的并不是用來制作生物反應器，1978年Mcknight等用輸卵管細胞來研究抗生物素蛋白。Sa11y等［7］首先研究成功雞輸卵管細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，輸卵管細胞能快速增殖，并被誘導表達了白蛋白。

目前，研制生物反應器，需要供受體動物的數(shù)量較多，試驗周期較長，研制成本較高［8］。為了減少試驗的盲目性、縮短試驗周期和降低成本，不同的轉基因個體也存在著很大差異，也會對表達的結果造成許多偏差。有必要在動物轉基因之前，利用一些簡便、經(jīng)濟、客觀的方法對基因的表達特性進行初步驗證。目前常用的方法有細胞表達分析法和轉基因小鼠分析法。禽類輸卵管生物反應器成功的關鍵在于使用卵清蛋白調控元件，構建合理有效的輸卵管組織特異性表達載體。因此，表達載體構建的合理性和有效性，快速檢測系統(tǒng)的建立對于這一研究領域具有重要意義。禽類輸卵管上皮細胞是研究乳蛋白基因表達及調控的理想細胞模型。體外適當條件下培養(yǎng)的原代輸卵管上皮細胞能保持原有的細胞分化和表達能力，利用脂質體介導轉染方法將外源基因導入到細胞中，通過提取基因組DNA、PCR方法檢測外源基因整合到細胞的情況；蛋白水平檢測，主要通過SDS-PAGE檢測外源蛋白的分泌表達。

顯微鏡觀察熒光表達情況，輸卵管上皮細胞中有表達報告基因GFP的細胞，分泌型的EGFP在細胞質中分布不均，呈斑點狀存在，熒光強度參差不齊，細胞核不易分辨，這可能與分泌型蛋白在細胞質網(wǎng)膜系統(tǒng)中運轉有關。而在鵪鶉成纖維細胞中未見清晰的熒光表達細胞，這可能是成纖維細胞缺乏卵清蛋白調控序列所需的凡是作用因子有關。宇麗等［9］將氯霉素乙酰轉移酶（CAT）基因與克隆的雞卵清蛋白上游5’調控區(qū)1.1 kb的序列融合，構建了表達載體，轉染雞原代輸卵管上皮細胞和雞成纖維細胞，結果在雞成纖維細胞上，不論有無類固醇激素存在，均不表達；而在雞原代輸卵管上皮細胞上，轉染后48 h表達量最高，為 0.67 μg/L。Dierich等［10］用纖維注射的方法將含有卵清蛋白5’調控序列的質粒表達載體轉入多種細胞，結果外源基因也不在雞胚成纖維細胞、腎細胞和其他非雞源細胞中表達。這與本試驗的結果是一致的。

［1］ Muramatsu T,Imai T.Gene gun-mediated in vivo ana1ysis of tissue repression of gene transcription driven by the chicken ova1bumin promotor the 1iver and oviduct of 1aying hens［J］.Mo1Ce11Biochem,1998,185(1/2):27-32.

［2］ Ochiai H,Park H M,Sasaki R,et a1.Gene gun-mediated human erythropoietin gene expression in pI cu1tured oviduct ce11s from 1aying hens［J］.Asian-Aust JAnim Sci,1999,12(1):9-14.

［3］ 宇麗,趙君,張艷玲,等.雞卵清蛋白基因上游調控序列表達載體的構建及其在雞原代輸卵管上皮細胞及雞成纖維細胞的表達［J］.中國獸醫(yī)學報,2001,21(1):21-24.

［4］ 王瓞,林其誰.核酸轉染技術和陽離子脂質體［J］.細胞生物學雜志,1998,20(1):21-25.

［5］ 陳吉祥,薛飛群,李廣林,等.脂質體介導基因轉移的研究進展［J］.微生物學通報,1999,26(3):223-225.

［6］ 楊靜平,孔玉英.脂質體——高效介導DNA轉染的新試劑［J］.生物化學與生物物理學報,1993,25(3):231-237.

［7］ Sa11y S,Seaver S,Raird,et a1.The chicken oviduct intissue cu1ture［J］.Exp Ce11Res,1984,155:256-260.

［8］ 李震,陳永福.乳腺生物反應器細胞模型建立的問題探討［J］.農(nóng)業(yè)生物技術學報,1997,5(2):148-152.

［9］ Yu L，Zhao J，Zhang Y L，et a1.Construction of the expression vector 5’f1anking regu1atory regions of the chicken ova1bumin gene in chicken primary oviduct ce11 and chicken fibrob1asts ce11 cu1tures.［J］.Chinese Journa1 of Veterinary Science,2001,21(1):21-24.

［10］ Dierich A,Gaub M P,Lepennec JL,et a1.Ce11-specificity of the chicken ova1bumin and cona1bumin promoter［J］.EMBOJ,1987(6):2305-2312.