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(1.廣東省東莞市石排醫(yī)院 普外科，廣東 東莞 523330；2.南方醫(yī)科大學(xué) 南方醫(yī)院 肝膽外科，廣東 廣州 510515)

基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)

c-Kit+Lin-細(xì)胞體外擴(kuò)增及體內(nèi)分化的實(shí)驗(yàn)研究

張春興1，王芳1，廖彩仙2，吳亞瓊1，蔣建武1

(1.廣東省東莞市石排醫(yī)院 普外科，廣東 東莞 523330；2.南方醫(yī)科大學(xué) 南方醫(yī)院 肝膽外科，廣東 廣州 510515)

目的研究移植剛分選及擴(kuò)增后雄性小鼠的骨髓c-Kit+Lin-細(xì)胞到酒精性肝纖維化雌性模型小鼠體內(nèi)后，模型小鼠的肝臟形態(tài)改變、肝功能變化和移植細(xì)胞的分布、分化及歸巢情況。方法采用酒精灌胃法建立酒精性肝纖維化雌性小鼠模型，造模成功后隨機(jī)選取8只模型小鼠(模型組)與正常小鼠8只(對(duì)照組)比較兩組肝功能變化。剩余模型小鼠再隨機(jī)選取32只，分為4組處理，并再隨機(jī)選取8只正常小鼠(第1組)與其對(duì)照。模型小鼠的4組分別為：移植前取血處死組(第2組)，移植新鮮分選的c-Kit+Lin-細(xì)胞組(第3組)，移植擴(kuò)增后的c-Kit+Lin-細(xì)胞組(第4組)，僅予以注射Buffer組(第5組)。采用免疫磁珠法分選雄性小鼠骨髓c-Kit+Lin-細(xì)胞；利用SCF+ HGF+ FL+LIF +TPO+ IL-3因子組合對(duì)其進(jìn)行體外擴(kuò)增；將剛分選及擴(kuò)增后c-Kit+Lin-細(xì)胞移植入酒精性肝纖維化雌性模型小鼠體內(nèi)，檢測(cè)兩組肝功能改變、肝臟纖維化改善、含雄性小鼠Y染色體性別決定基因cDNA(Sry)的移植細(xì)胞在受體肝內(nèi)定居分化情況。結(jié)果(1) 兩移植組在移植30天后，較移植前肝臟纖維化改善明顯；(2) 兩移植組在移植30天后AST、ALT、ALB與移植前比較差異有顯著性意義(P<0.05)；(3)兩移植組均可見(jiàn)含雄性小鼠Y染色體性別決定基因cDNA(Sry)的移植細(xì)胞，并同時(shí)表達(dá)ALB mRNA，計(jì)數(shù)細(xì)胞比例，比較差異無(wú)顯著性意義(P>0.05)。結(jié)論移植c-Kit+Lin-細(xì)胞后能在受體肝內(nèi)定居并轉(zhuǎn)化成有功能新生肝細(xì)胞；移植c-Kit+Lin-細(xì)胞后能明顯改善肝損傷小鼠的肝功能及肝臟纖維化；擴(kuò)增對(duì)c-Kit+Lin-細(xì)胞的歸巢、在體內(nèi)分化沒(méi)有明顯影響。

骨髓衍生肝干細(xì)胞；免疫磁珠分選；體外擴(kuò)增培養(yǎng)；干細(xì)胞移植；c-Kit+Lin-細(xì)胞

骨髓細(xì)胞可以分化形成肝細(xì)胞的特定干細(xì)胞群，被稱(chēng)之為骨髓衍生肝干細(xì)胞(bone marrow derived liver stem cells BMDLSC)，已被眾多學(xué)者公認(rèn)[1-2]，為肝臟疾病治療提供了新思路和新手段。有研究者在不同的實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)c-kit+Lin-是一群富含BMDLSC的骨髓干細(xì)胞群。與其他類(lèi)型的骨髓干細(xì)胞類(lèi)似，c-kit+Lin-細(xì)胞的含量低、數(shù)量有限，難以滿(mǎn)足未來(lái)應(yīng)用的需要[3-4]。

本實(shí)驗(yàn)利用免疫活性細(xì)胞磁珠分選法(magnetic activated cell separation，MACS)對(duì)雄性小鼠c-kit+Lin-細(xì)胞進(jìn)行分選提純[5]。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)，參照臍血造血干細(xì)胞、骨髓造血干細(xì)胞的體外擴(kuò)增培養(yǎng)，本實(shí)驗(yàn)選用SCF+HGF+FL+LIF+TPO+IL-3因子組合在STEMPRO-34 SFM 無(wú)血清培養(yǎng)基中對(duì)其進(jìn)行體外擴(kuò)增，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)c-kit+Lin-細(xì)胞數(shù)。將剛分選及擴(kuò)增后雄性小鼠c-kit+Lin-細(xì)胞移植入酒精性肝纖維化雌性模型小鼠體內(nèi)，檢測(cè)移植前后酒精性肝纖維化模型雌性小鼠的肝功能，利用雙重原位雜交的方法檢測(cè)雌性小鼠肝臟中存在Y染色體性別決定基因cDNA(Sry)陽(yáng)性和ALBmRNA陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)量，比較兩組小鼠的肝臟形態(tài)、肝功能變化和移植細(xì)胞的分布、分化及歸巢情況。為將來(lái)臨床上進(jìn)行骨髓衍生肝干細(xì)胞肝內(nèi)移植治療肝疾病奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 酒精性肝纖維化雌性小鼠模型的建立及分組

6～7周齡BALB/C雌性小鼠80只，隨機(jī)分兩組，模型組64只，對(duì)照組16只。采用酒精灌胃法，模型組給予54度白酒(酒鬼酒股份有限公司生產(chǎn)，湘泉500 mL，54度)每天灌胃2次共16周，同時(shí)將54度白酒用蒸餾水配制成含酒精10% (v/v)白酒為唯一飲料。第1周～第3周末灌胃量為每次8 mL/kg，第4周～第7周末灌胃量為每次10 mL/kg，第8周～第16周末灌胃量為每次12 mL/kg。對(duì)照組無(wú)特殊處理，飲用自來(lái)水。實(shí)驗(yàn)期間均予全價(jià)營(yíng)養(yǎng)顆粒飼料喂養(yǎng)。第16周末模型組死亡16只，死亡率為25%，剩余48只，對(duì)照組無(wú)死亡。造模成功后隨機(jī)選取8只模型組小鼠，與8只正常對(duì)照組小鼠比較兩組肝功能變化。剩余模型小鼠再隨機(jī)選取32只，分為4組處理，并再選取其余8只正常小鼠(第1組)與其對(duì)照。模型小鼠的4組分別為：移植前取血處死組(第2組)，移植新鮮分選的c-Kit+Lin-細(xì)胞組(第3組)，移植擴(kuò)增后的c-Kit+Lin-細(xì)胞組(第4組)，僅予以注射Buffer組(第5組)。每組8只，剩余8只模型小鼠棄之不用。

1.2 肝功能檢測(cè)

模型組和對(duì)照組的各8只小鼠，眼球采血后，頸椎脫臼處死，處死前禁食12 h。小鼠處死后立即取出肝臟用10%的甲醛固定，脫水后石臘包埋切片，蘇木精-伊紅(HE)染色和苦味酸-酸性品紅(VG)染色，光鏡觀(guān)察病理變化。血標(biāo)本用于測(cè)定ALB、AST、ALT。

1.3 免疫磁珠法分離骨髓c-kit+Lin-細(xì)胞

取5只6～7周齡Balb/c雄性小鼠，頸椎脫臼處死，置75%的酒精浸泡15 min；無(wú)菌取出，解剖雙側(cè)股骨,離斷兩端骨骺,DMEM液反復(fù)沖洗骨髓腔；細(xì)胞懸液吹打后加入紅細(xì)胞裂解液6 mL，30 μm 400目尼龍膜過(guò)濾，獲取細(xì)胞懸液。利用德國(guó)Miltenyi Biotec公司Lin-細(xì)胞單抗分離系統(tǒng)(MACS) 分離，收集Lin-細(xì)胞，在此基礎(chǔ)上再陽(yáng)性分選出c-Kit+細(xì)胞，得到c-kit+Lin-細(xì)胞。分離方法按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。利用流式細(xì)胞儀(BD公司) 檢測(cè)分選的c-kit+Lin-細(xì)胞。

1.4 c-Kit+Lin-細(xì)胞短期培養(yǎng)

白細(xì)胞介素-3(IL-3)，干細(xì)胞因子(SCF)，F(xiàn)Lt-3配基(FL)和白血病抑制因子(LIF)及血小板生成素(TPO)購(gòu)自美國(guó)Peprotech公司，HGF購(gòu)自eBioscience公司。SCF，LIF,FL 和TPO終濃度為50 ng/mL HGF終濃度為10 ng/mL,IL-3終濃度為20 ng/mL。培養(yǎng)體系為STEMPRO -34 SFM 無(wú)血清培養(yǎng)基(GIBCO公司) 。c-Kit+Lin-細(xì)胞初始濃度為5×104/ mL,將c-Kit+Lin-細(xì)胞接種于24 孔培養(yǎng)板中,每孔1 mL,復(fù)種8孔,在37 ℃、5 % CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)7天。培養(yǎng)第3天半量換液,第7天計(jì)算細(xì)胞總數(shù)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)c- Kit+Lin-細(xì)胞數(shù)。

1.5 模型雌性小鼠移植雄性小鼠骨髓c-Kit+Lin-細(xì)胞

第3組移植新鮮分選的c-Kit+Lin-細(xì)胞組，第4組移植擴(kuò)增后的c-Kit+Lin-細(xì)胞組，第5組僅予以注射Buffer。擴(kuò)增后及剛分選的c-Kit+Lin-細(xì)胞分別進(jìn)行計(jì)數(shù)， 8 ℃條件下1 500 r/min離心10 min，棄上清，加入Buffer22.5 mL重懸細(xì)胞。調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度1×106個(gè)/mL，第3組、第4組每只予100 μL細(xì)胞懸液尾靜脈注射。第5組僅予以注射Buffer2100 μL。

1.6 移植前后肝功能檢查、肝組織常規(guī)病理檢查

移植前第1組、第2組全部小鼠眼球采血后，頸椎脫臼處死，小鼠處死后立即取出肝臟。第3、4、5組30天后無(wú)小鼠死亡，全部小鼠眼球采血后，頸椎脫臼處死。小鼠處死后立即取出肝臟。測(cè)量血清中ALT、AST和ALB等肝功能指標(biāo)；肝臟給予石蠟包埋，按標(biāo)準(zhǔn)操作行HE、VG染色，HE染色觀(guān)察小鼠肝臟病理改變，包括肝細(xì)胞的變性、壞死、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；VG染色觀(guān)察小鼠肝臟膠原纖維的增生(染色后膠原纖維呈紅色)。

1.7 白蛋白mRNA和Y染色體Sry基因DNA雙重原位雜交

設(shè)立嚴(yán)格的對(duì)照組，陰性對(duì)照為BALB/C雌性小鼠肝組織。ALB mRNA探針序列：5’-TTGGCAAGTT CCGCCCTGTC ATCTGCGC (TAMRA紅色熒光標(biāo)記，PCR擴(kuò)增時(shí)參入dupt-TAMRA)；Sry基因DNA探針序列：5’-GCTGGGATGC AGGTGGAAAA GCCTTACAG(FAM綠色熒光標(biāo)記，PCR擴(kuò)增時(shí)參入dupt-FAM)。

小鼠白蛋白mRNA探針根據(jù)GenBank登記號(hào)為：AJ011413設(shè)計(jì)；Y染色體性別決定區(qū)序列根據(jù)GenBank登記號(hào)為：NM0 11564設(shè)計(jì)DNA探針。其中Y染色體DNA探針由FAM標(biāo)記，激發(fā)后顯綠色熒光；ALB mRNA探針由TAMRA標(biāo)記，激發(fā)后顯紅色熒光。當(dāng)細(xì)胞同時(shí)表達(dá)ALB mRNA和Y染色體DNA時(shí)，紅色與綠色疊加而形成黃色。

按原位雜交方法操作，在同一切片上先行ALBmRNA原位雜交，雜交后滴加Y染色體Sry基因 DNA探針。在熒光顯微鏡下激發(fā)各自波長(zhǎng)，分別照相，并進(jìn)行圖像融合，每張切片隨機(jī)選取10個(gè)視野(油鏡)，每個(gè)視野細(xì)胞數(shù)約20個(gè)，記錄雙陽(yáng)性細(xì)胞率。每組取8張切片計(jì)數(shù)，了解移植細(xì)胞肝內(nèi)轉(zhuǎn)化情況。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 酒精性肝纖維化模型小鼠的肝功能變化

模型組小鼠的肝功能與對(duì)照組相比，肝功能損害明顯。見(jiàn)表1。

表1酒精性肝纖維化模型小鼠的血清生化指標(biāo)比較

生化指標(biāo)對(duì)照組模型組tPALB(U/L)38．97±4．5626．26±3．486．2680．000AST(U/L)147．23±12．63286．65±30．92-11．8080．000ALT(g/L)43．41±5．27150．02±13．30-21．0740．000

與對(duì)照組比較，P均<0.001

2.2 MACS分離c-Kit+Lin-細(xì)胞的純度及回收率

MACS分離c-Kit+Lin-細(xì)胞純度均達(dá)到85%，回收率達(dá)到80%以上。

2.3 細(xì)胞總數(shù)擴(kuò)增結(jié)果

在7天的培養(yǎng)過(guò)程中,細(xì)胞總數(shù)增加163.34倍,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)c-Kit+Lin-細(xì)胞數(shù)，c-Kit+Lin-細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)為18.75倍。

2.4 移植c-Kit+Lin-細(xì)胞后病理學(xué)變化

雌性酒精性肝纖維化模型小鼠移植剛分選細(xì)胞組(第3組)和移植擴(kuò)增細(xì)胞組(第4組)：移植30天后，肝組織HE染色顯示：肝細(xì)胞無(wú)明顯壞死，細(xì)胞濁腫、變性減輕，部分細(xì)胞接近正常形態(tài)；肝竇區(qū)無(wú)明顯炎性浸潤(rùn)，核分裂相少，增生不明顯，肝索排列有序，匯管區(qū)纖維化減輕。VG染色見(jiàn)肝小葉中央靜脈壁、匯管區(qū)及肝竇內(nèi)的粉紅色膠原纖維與移植前雌性酒精性肝纖維化模型小鼠(第2組)相比有所減少。

雌性酒精性肝纖維化模型小鼠注射Buffer2組(第5組)：30天后，肝組織HE染色顯示：肝小葉仍可見(jiàn)點(diǎn)狀壞死及小灶狀壞死，肝細(xì)胞胞體腫大呈球形；肝竇受壓，肝索紊亂，并可見(jiàn)少數(shù)假小葉形成。VG染色可見(jiàn)匯管區(qū)血管壁明顯增厚，肝竇周?chē)写罅糠奂t色膠原纖維散在分布，并且肝小葉中央靜脈之間仍可見(jiàn)膠原纖維相連。

2.5 移植30天后小鼠肝臟功能變化

兩移植組小鼠30天后肝功能損害較移植前模型小鼠(第2組)及僅予以注射Buffer2的小鼠(第5組)改善明顯。注射Buffer2小鼠肝功能無(wú)明顯改善。各組肝功能結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 30天后各組肝功能變化

組別AST(U/L)ALT(U/L)ALB(g/L)第1組147．34±19．4841．88±10．5439．99±5．46第2組274．05±32．451)2)142．51±10．531)2)28．32±2．691)2)第3組150．57±11．5543．34±5．5038．72±4．17第4組151．13±13．0844．37±4．6036．68±3．41第5組275．26±32．07145．45±10．6027．16±2．94

1)與第1組(對(duì)照組)比較，P<0.05；2)與第3組、第4組比較，P<0.05

2.6 雙重原位雜交,雙陽(yáng)性細(xì)胞的比例

移植剛分選細(xì)胞組和移植培養(yǎng)后細(xì)胞組雙重原位雜交,均可見(jiàn)含雄性小鼠Y染色體性別決定基因cDNA(Sry)的移植細(xì)胞，并同時(shí)表達(dá)ALB mRNA，雙陽(yáng)性細(xì)胞的比例無(wú)明顯差異，分別為3.90±1.02 和3.55±0.70，P>0.05。

3 討 論

對(duì)于酒精性肝損傷模型，國(guó)外已經(jīng)創(chuàng)建成形的有Lieber-Decarli模型、Tsukamoto -French 模型和Lieber-Decarli 液體食料加輔劑模型[6-8]。由于此類(lèi)造模方法較復(fù)雜，而且造價(jià)較高，國(guó)內(nèi)較少有人采用。本實(shí)驗(yàn)中乙醇的起始量為54%酒精8 mL/kg，每天灌胃2次，同時(shí)飲用酒精飲料，隨實(shí)驗(yàn)的推進(jìn)，兩次調(diào)整酒精的劑量，逐步增加酒精灌注量，有利于維持血中較高酒精濃度，避免一次給酒劑量太大導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)急性酒精中毒而死亡。在 16 周末成功建立了酒精性肝纖維化模型。酒精性肝纖維化模型組小鼠的肝功能與正常對(duì)照組相比，肝功能損害明顯。在模型制備過(guò)程中小鼠共死亡16只，死亡率為25%。這種造模方法也接近國(guó)人的飲酒習(xí)慣，適合中國(guó)國(guó)情，且方法簡(jiǎn)便易行，費(fèi)用低，適合于酒精性肝病的發(fā)病機(jī)理及肝細(xì)胞的移植治療的研究。

越來(lái)越多的試驗(yàn)證實(shí)骨髓干細(xì)胞參與了肝組織再生過(guò)程[9]。與其他類(lèi)型的骨髓干細(xì)胞類(lèi)似，c-Kit+Lin-細(xì)胞的含量低、數(shù)量有限，必須對(duì)其進(jìn)行分選、提純、擴(kuò)增。MACS細(xì)胞分選系統(tǒng)能有效分選c-Kit+Lin-細(xì)胞，純度和回收率均較高[5]。IL-3,LIF,FL,TPO和SCF是廣泛應(yīng)用于體外擴(kuò)增干細(xì)胞的細(xì)胞因子[10]。IL-3是非特異性細(xì)胞因子，由T淋巴細(xì)胞受分裂劑或抗原刺激后產(chǎn)生的一種淋巴因子，其功能主要是維持處于G0期之外的所有干細(xì)胞的增殖[11]。且與TPO聯(lián)用時(shí)能提高擴(kuò)增效率。LIF常用于胚胎干細(xì)胞(ESC)的培養(yǎng)，能抑制其分化并保持增殖能力，是ESC體外培養(yǎng)不可缺少的細(xì)胞因子之一[12]。SCF能誘導(dǎo)骨髓或臍血CD34+等干/祖細(xì)胞由靜止期進(jìn)入增殖期，通常和其他因子合用，并能夠起到協(xié)同擴(kuò)增的效果。FL促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂的能力較弱,但卻有很強(qiáng)的維持祖細(xì)胞能力，在擴(kuò)增干祖細(xì)胞的同時(shí)還能抑制其分化[13]。SCF和FL同屬于酪氨酸激酶TKP家族，可啟動(dòng)早期祖細(xì)胞的分裂和增殖[14]。TPO的配基為MPL，是巨核細(xì)胞系特異性的生長(zhǎng)因子，通過(guò)激活JANUS激酶2，介導(dǎo)G蛋白信號(hào)系統(tǒng)，從而刺激細(xì)胞增殖，但近年來(lái)實(shí)驗(yàn)證實(shí)對(duì)維持和調(diào)節(jié)早期干/祖細(xì)胞增殖的自我更新有重要作用[15]。HGF主要由肺、肝等臟器分泌，不僅可以刺激肝細(xì)胞還可以刺激各種上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等增殖。在干細(xì)胞方面，HGF主要應(yīng)用于誘導(dǎo)干細(xì)胞的定向分化[16]。本研究在無(wú)血清條件下采用SCF+FL+HGF+TPO+LIF+IL-3組合培養(yǎng)c-Kit+Lin-細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，干細(xì)胞有部分分化，形態(tài)上顯微鏡下可見(jiàn)變得大小不一致的細(xì)胞；細(xì)胞總數(shù)擴(kuò)增163.34倍，而c-Kit+Lin-細(xì)胞擴(kuò)增18.75倍。

本實(shí)驗(yàn)利用酒精性肝纖維化雌性小鼠模型作為受體，將剛分選雄性小鼠骨髓c-Kit+Lin-細(xì)胞、培養(yǎng)后雄性小鼠骨髓c-Kit+Lin-細(xì)胞移植入雌性模型小鼠體內(nèi)，通過(guò)肝臟形態(tài)學(xué)、組織學(xué)變化及肝功能等指標(biāo)評(píng)價(jià)干細(xì)胞修復(fù)肝損傷的效果；同時(shí)利用雄性小鼠的Y染色體性別決定基因cDNA(Sry)為標(biāo)記，通過(guò)原位雜交檢測(cè)雌性小鼠損傷肝臟中存在Sry陽(yáng)性的細(xì)胞，以觀(guān)察移植干細(xì)胞在肝臟形態(tài)、分布、分化及歸巢情況。熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization,FISH) 技術(shù)是Pinkel等于1986 年在放射性原位雜交的基礎(chǔ)上創(chuàng)建的,本實(shí)驗(yàn)采用的是相對(duì)簡(jiǎn)單的雙重(雙色)原位雜交的方法，根據(jù)小鼠ALB mRNA(GenBank登記號(hào)為：AJ011413設(shè)計(jì))和Y染色體性別決定區(qū)序列(GenBank登記號(hào)為：NM011564)設(shè)計(jì)合成探針，并根據(jù)顏色疊加的原理，當(dāng)細(xì)胞同時(shí)表達(dá)ALB mRNA所表達(dá)的紅色與表達(dá)Y染色體的黃色相復(fù)合后就可見(jiàn)黃色熒光。

移植雄性小鼠骨髓c-Kit+Lin-細(xì)胞入模型小鼠體內(nèi)30 天后，兩移植組小鼠肝纖維化較移植前模型小鼠及僅予以注射Buffer的小鼠均有明顯減輕，肝細(xì)胞在形態(tài)上均接近正常。兩移植組小鼠ALB、AST、ALT也明顯改善，均接近正常。兩移植組小鼠的肝臟都檢測(cè)到了同時(shí)表達(dá)ALB mRNA與表達(dá)Y染色體的細(xì)胞，且兩組比較無(wú)明顯差異，而在僅予以注射Buffer2的小鼠Y染色體的細(xì)胞表達(dá)陰性。由此可以推測(cè)，移植的雄性小鼠骨髓c-Kit+Lin-細(xì)胞定居在模型雌性小鼠肝臟，分化為有功能的新生肝細(xì)胞，能明顯改善肝損傷小鼠的肝功能及肝臟纖維化，而且體外擴(kuò)增培養(yǎng)后對(duì)c-Kit+Lin-細(xì)胞的定居、分布、分化及歸巢無(wú)明顯影響。而僅注射Buffer2不能改善模型小鼠肝臟損害。

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Studyoftheexpansionofc-kit+Lin-cellsandthepotentialofdifferentiationintolivercellinmouse

ZHANGChun-xing1,WANGFang1,LIAOCai-xian2,WUYa-qiong1,JIANGJian-wu1

(1.DepartmentofGeneralSurgery,ShipaiHospitalofDongguanCity,Dongguan523330,China; 2.DepartmentofHepatobiliarySurgery,NanfangHospitalofSouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China)

ObjectiveTo elucidate the liver function recovery and the translated stem cells’location and differentiation of the hepatic fibrosis female rats induced by alcohol in the group of translated expanded and fresh isolated c-Kit+Lin-cells.MethodsWe used alcohol to establish the female rats hepatic fibrosis model. After the modeling randomly selected eight mice (model group) compared with normal mice (control group) liver function. The remaining mice were randomly selected 32 divided into 4 groups.Randomly selected eight normal mice (group 1)as a control group.C-kit+Lin-cells were isolated from mouse bone marrow by using a high-gradient magnetic cell sorting system (MACS),and expanded with combinations of SCF+ HGF+ FL+LIF +TPO+ IL-3 for 7days in a liquid culture system. We translated the expanding c-kit+Lin-cells into the normal female rats and hepatic fibrosis female rats induced by alcohol. Observe the translated stem cells'location and differentiation in the rats body and count the cells which expressed both gene of Sry,and compare the two group.Results(1) After 30 days,HE and VG histological examination showed that the translated groups were less fibrosis and the control group obviously. (2) After 30 days,AST,ALT,ALB after transplantation compared with pretrans-plant significant difference (P<0.05). (3) Results of hybridization of Y-chromosome determined cDNA and albumin mRNA indicated that in the translated group there existed hepatic cells which derived from stem cells in the liver. The difference was not statistically significant (P>0.05).ConclusionIn this experiment condition,expanding c-Kit+Lin-cell did not effect the stem cells location and differentiation. The liver function recovery in the group translated and fresh isolated c-Kit+Lin-cells ，reverse the liver fibrosis and there existed hepatic cells which derived from stem cells in the liver.

bone marrow derived liver stem cells; MACS; expand and culture in vitro; stem cell transplantation; c-Kit+Lin-cells

10.11724/jdmu.2013.06.07

R457.7

A

1671-7295(2013)06-0538-05

張春興，王芳，廖彩仙，等. c-Kit+Lin-細(xì)胞體外擴(kuò)增及體內(nèi)分化的實(shí)驗(yàn)研究[J].大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2013,35(6)：538-542.

張春興(1977-)，男，江西吉安人，主治醫(yī)師，碩士。E-mail：550193985@qq.com

2013-09-16；

2013-11-05)