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(1.大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院 口腔科，遼寧 大連116011；2.大連市疾病預(yù)防控制中心， 遼寧 大連 116000)

醫(yī)學(xué)檢驗

米諾環(huán)素輔助治療牙周炎前后牙齦卟啉單胞菌的定量檢測

萬君1，李秋紅1，王如1，韓焱2，薄志堅2

(1.大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院 口腔科，遼寧 大連116011；2.大連市疾病預(yù)防控制中心， 遼寧 大連 116000)

目的對在基礎(chǔ)治療輔助米諾環(huán)素治療慢性牙周炎前后，實時定量檢測齦下菌斑中牙齦卟啉單胞菌(porphyromonas gingivalis，Pg)占總細菌構(gòu)成比。方法收集中、重度慢性牙周炎患者50例，根據(jù)隨機、自身對照的原則設(shè)計分組：未用藥側(cè)和藥物側(cè)(藥物側(cè)牙周基礎(chǔ)治療后牙周袋內(nèi)放置鹽酸米諾環(huán)素)。記錄治療前、治療后1、3個月時各項臨床指標(biāo),并提取牙周袋內(nèi)菌斑，應(yīng)用TaqMan Real-time PCR方法對齦下菌斑進行定量檢測，對數(shù)據(jù)做統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果Pg構(gòu)成比結(jié)果顯示：兩組治療前均為68%，兩組治療后1個月未用藥側(cè)30%、藥物側(cè)28%；3個月時Pg構(gòu)成比未用藥側(cè)24%，藥物側(cè)22%，均低于治療前，差異有顯著性意義(P<0.05)；用藥側(cè)與未用藥側(cè)Pg構(gòu)成比治療后3個月均低于治療后1個月，差異無顯著性意義(P>0.05);用藥側(cè)治療后1、3個月與未用藥側(cè)比較，差異無顯著性意義(P>0.05)。Pg構(gòu)成比與臨床指標(biāo)探診深度、出血指數(shù)和牙周附著水平成正相關(guān)性(P<0.05)。結(jié)論牙周病患者經(jīng)基礎(chǔ)治療后能夠減少齦下菌斑中Pg的構(gòu)成比，而且可以在3個月內(nèi)保持療效，其中牙周基礎(chǔ)治療起關(guān)鍵性作用，鹽酸米諾環(huán)素輔助用藥對臨床治療效果的改善不明顯。

牙齦卟啉單胞菌；實時定量PCR;米諾環(huán)素

牙菌斑生物膜是引發(fā)牙周疾病必不可少的始動因子。牙齦卟啉單胞菌(porphyromonas gingivalis，Pg)已被認為是重要的牙周致病菌之一，Komiya等[1]報道其為紅色復(fù)合體中重要的致病菌。

牙周病治療計劃第一階段，即基礎(chǔ)治療/病因治療，其目的為消除局部刺激因素和控制菌斑?；A(chǔ)治療包括自我控制菌斑，潔治術(shù)、刮治術(shù)和根面平整術(shù)(scaling and root planing,SRP)，這是基礎(chǔ)治療最核心內(nèi)容。而藥物輔助治療是患者愿意接受的治療方法。目前多數(shù)學(xué)者認為米諾環(huán)素(Minocycline)[2]是牙周基礎(chǔ)治療中輔助SRP治療最有前途的一種形式。商品名為派麗奧(Periocline)，通用名為鹽酸米諾環(huán)素軟膏是其中一種藥物。

本研究對中、重度慢性牙周炎患者，進行牙周基礎(chǔ)治療，患者自身對照，一側(cè)單純牙周基礎(chǔ)治療，一側(cè)牙周基礎(chǔ)治療后應(yīng)用鹽酸米諾環(huán)素(Minocycline)牙周袋上藥。在治療前后提取牙周袋內(nèi)菌斑，應(yīng)用Real-time PCR的檢測方法對菌斑中牙齦卟啉單胞菌占細菌總量的構(gòu)成比進行定量檢測，通過研究，指導(dǎo)臨床，以期獲得良好的臨床效果。

1 材料和方法

1.1 試劑及儀器

試劑：牙齦卟啉單胞菌(Pg) ACTT 33277(四川大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院饋贈)；鹽酸米諾環(huán)素軟膏(Sunstar株式會社，日本)；樹脂型TM基因組DNA提取試劑盒(北京賽百盛基因技術(shù)有限公司)；Premix Ex TaqTM(Perfect Real Time)(寶生物工程大連有限公司)。

實驗儀器：無菌超聲波潔治器、Gracey刮治器(上海康橋齒科醫(yī)械廠)；Wiliams牙周探針(上海康橋齒科醫(yī)械廠)；無菌操作臺(蘇州億達凈化實驗室設(shè)備有限公司)；Thermo Scientific IEC Multi/Multi RF 離心機(Thermo fisher，美國)；ABI Prism 7500 Fast Real-Time PCR System(ABI Prism?，美國)。

1.2 病例采集

收集2010的3月—2012年3月大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院就診的慢性牙周炎患者50例，其中男23例，女27例；年齡20～65歲，平均43歲。每例患者選取左、右各1個位點，共100顆牙齒，100個位點。病例納入標(biāo)準：符合慢性牙周炎(CP)診斷標(biāo)準：1999年新分類法[3]；無全身系統(tǒng)性疾病史；無吸煙史；3個月內(nèi)無牙周病治療史；1個月內(nèi)無抗菌藥和非甾體類抗炎藥物服用史；婦女無妊娠、哺乳；無藥物過敏史(尤其是四環(huán)素類藥物)；患者知情同意。

1.3 指標(biāo)測量標(biāo)準及方法

主要臨床指標(biāo)：探診深度(probing depth，PD)；出血指數(shù)(bleeding index,BI)；附著水平(attachment level,AL)。

實驗前準備：對于符合實驗要求的患者，經(jīng)本人及家屬知情同意后，建立牙周檔案；行必要的輔助檢查：如X線片、血常規(guī)等；根據(jù)患者自身條件，擬定治療計劃；進行口腔衛(wèi)生宣教。如患牙伴有牙體牙髓病變、頜創(chuàng)傷等同期為其進行相應(yīng)的治療。

實驗治療計劃：(1)齦上潔治后行牙周檢查，記錄各項臨床指標(biāo)。對于每位入選患者選取左右各1個位點，進行菌斑采集。位點選取標(biāo)準:PD≥4 mm，AL≥3 mm。齦下菌斑采集方法：局部隔濕、吹干后，去除齦上菌斑，用無菌刮治器至待測位點牙周袋最深部，采集菌斑，裝入標(biāo)記好的無菌Ep管(含1 mLPBS)中。-20 ℃儲存?zhèn)溆谩?2)齦下刮治、根面平整。對于不同患者，根據(jù)個人情況行一次性或全口齦下刮治、根面平整。(3)設(shè)計分組：藥物側(cè)和未用藥側(cè)。依據(jù)隨機、自身對照原則，按患者就診順序進行排列，查隨機數(shù)表，若為單數(shù)則左側(cè)位點為藥物側(cè)，右側(cè)為未用藥側(cè)；雙數(shù)相反。藥物側(cè)：牙周袋內(nèi)使用鹽酸米諾環(huán)素軟膏，使用方法按照說明書要求，1次/周，療程4周。4周后結(jié)束用藥。未用藥側(cè)：無特殊處理。(4)再次牙周檢查、采集菌斑：分別于牙周基礎(chǔ)治療后1個月、3個月后，相同位點，進行菌斑采集。記錄各項臨床指標(biāo)，方法同前。

1.4 TaqMan實時熒光定量PCR檢測

DNA提?。喊凑諛渲蚑M基因組DNA提取試劑盒的操作步驟提取，-20 ℃儲存?zhèn)溆?。TaqMan實時熒光定量PCR檢測：標(biāo)準菌株為P.gingivalis ATCC 33277，由四川大學(xué)饋贈。引物設(shè)計：通用菌引物[4]和Pg的引物[5](表1)均由寶生物工程(大連)有限公司委托合成。標(biāo)準曲線的制備：分別將通用菌和Pg標(biāo)準品DNA按10倍梯度稀釋作為模板,繪制標(biāo)準曲線。反應(yīng)體系 20 μL：Premix Ex TaqTM:10 μL；上、下游引物各0.4 μL；TaqMan探針：0.8 μL；ROX Reference Dye:0.4 μL;DNA模板：2 μL；ddH2O：6 μL。反應(yīng)條件：變性溫度95 ℃，30 s；退火溫度95 ℃，5 s，進行40個循環(huán)；60 ℃延伸34 s，每個樣本均做通用菌和Pg的定量檢測。每次反應(yīng)均設(shè)空白對照、陽性對照和梯度稀釋的標(biāo)準品。Pg構(gòu)成比為Pg檢測的量占通用菌檢測的量的比例，用百分比表示。

表1 實時熒光定量PCR引物和探針

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

用統(tǒng)計分析軟件包SPSS11.5進行數(shù)據(jù)處理，Pg構(gòu)成比與PD、BI、AL數(shù)據(jù)采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)方法分析。Pg構(gòu)成比與PD、BI和AL的關(guān)系用相關(guān)分析(correlation analysis method)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

治療期間病例無失訪，所有入試者均能夠按時復(fù)診，臨床資料完整。

2.1 標(biāo)準曲線和Pg檢出率

本實驗條件下通用菌和Pg標(biāo)準品標(biāo)準曲線和擴增曲線見圖1,2,3,4。Pg檢出率檢測結(jié)果顯示，兩組治療前Pg檢出率均為68.0%，見表2。

圖1 通用菌標(biāo)準品標(biāo)準曲線

圖2 通用菌標(biāo)準品擴增曲線

圖3 Pg標(biāo)準品標(biāo)準曲線

圖4 Pg標(biāo)準品擴增曲線

表2 Pg檢出率結(jié)果

2.2 Pg構(gòu)成比

兩組治療后1個月、3個月均低于治療前，差異有顯著性意義(P<0.05)；每組治療后3個月均低于治療后1個月，差異無顯著性意義(P>0.05)；用藥側(cè)治療后1個月、3個月相對于治療前減少的量大于未用藥側(cè)，但差異無顯著性意義(P>0.05)。見表3。

表3 Pg構(gòu)成比結(jié)果

1)與治療前比較，P<0.05

2.3 臨床指標(biāo)的檢測結(jié)果

兩組治療后1個月、3個月均低于治療前，差異有顯著性意義(P<0.05)；每組治療后3個月均低于治療后1個月，差異無顯著性意義(P>0.05)；用藥側(cè)治療后1個月、3個月相對于治療前減少的量大于未用藥側(cè)，但差異無顯著性意義(P>0.05)。見表4。

表4 臨床指標(biāo)的檢測結(jié)果

1)與治療前比較，P<0.05

2.4 Pg構(gòu)成比與臨床指標(biāo)的相關(guān)性

Pg構(gòu)成比與臨床指標(biāo)PD、BI和AL呈正相關(guān)。相關(guān)系數(shù)分別為r=0.999，r=0.997，r=0.952，P均<0.05。

3 討 論

牙齦卟啉單胞菌是被公認為牙周病致病菌，檢出率高。潘亞萍等[6]總結(jié)國內(nèi)外對于慢性牙周炎中此菌的檢出率，結(jié)果為28.0%～97.4%。本實驗采用TaqMan Real-Time PCR方法，在治療前兩組的檢出率為68.0%，檢出率較高，同時也證實此菌在牙周病患者中的致病作用是不可忽視的。

近些年來對齦下菌斑中牙齦卟啉單胞菌的微生物檢測方法的研究很多，實時熒光聚合酶鏈式反應(yīng)(Quantitative real-time PCR)技術(shù)已投入于口腔微生物的定量分析。Kawada M等[7]對Pg進行了定量分析，研究發(fā)現(xiàn)牙周基礎(chǔ)治療后細菌的數(shù)量明顯減少，而且其數(shù)量與袋深呈顯著正相關(guān)性，即牙周袋深每增加1 mm，細菌的數(shù)量會增加10倍。本實驗的結(jié)果顯示慢性牙周炎牙周基礎(chǔ)治療之后，其Pg構(gòu)成比在治療后1個月、3個月均低于治療前。結(jié)果與Kawada M的結(jié)果有一致性。有研究發(fā)現(xiàn)慢性牙周炎患者牙齦卟啉單胞菌在基礎(chǔ)治療后12周時比6周時的相對含量有提高，差異有顯著性意義[8]。而本研究結(jié)果在治療后3個月時比1個月時Pg構(gòu)成比要低，但差異無顯著性意義。可能因為選擇的位點牙周狀況不同，患者的口腔衛(wèi)生維護水平不同等原因。

本實驗結(jié)果得出采用單純SRP治療與SRP和鹽酸米諾環(huán)素輔助治療兩組，治療前后Pg構(gòu)成比差異無顯著性意義，主要原因考慮為：一是構(gòu)成比的減少不能完全代替細菌總量的減少，兩組明顯的Pg致病菌在總細菌比例的減少和消滅說明牙周基礎(chǔ)治療對菌斑中Pg毒性克隆株的感染控制是有意義的；二是本研究選取的患者為有深牙周袋的慢性牙周炎患者，此類患牙處于長期慢性感染狀態(tài)，菌群生態(tài)環(huán)境不如急性期那樣輕易打破，相當(dāng)一部分患者經(jīng)基礎(chǔ)治療后，還需要進入牙周手術(shù)[9]治療階段，徹底地清除齦下菌斑。

牙菌斑生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，對于牙周病致病菌的感染控制臨床醫(yī)生目前主要采取的手段是機械性清除。而患者更歡迎藥物的使用，特別是局部使用的緩釋藥物，具有局部區(qū)域藥物濃度大，全身副作用小的優(yōu)勢。不能否認牙周基礎(chǔ)治療在牙周治療中的重要意義，期盼有特效局部藥物的應(yīng)用讓患者減少痛苦。

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Detectionandquantificationofporphyromonasgingivalisinchronicperiodontitisbeforeandafterminocyclinehydrochloridetherapy

WANJun1,LIQiu-hong1,WANGRu1,HANYan2,BOZhi-jian2

(1.DepartmentofDental,theFirstAffiliatedHospitalofDalianMedicalUniversity,Dalian116011,China; 2.DalianCenterforDiseaseControlandPrevention,Dalian116000,China)

ObjectiveUsing the TaqMan Real-time PCR to compare between the scaling and root planting treatment (SRP) and SPR with minocycline hydrochloride for detection and quantification of Porphyromonas gingivalis (Pg) taken from subgingival plaque in moderate or severe chronic periodontitis.MethodsWe collected 50 cases of moderate to severe periodontitis patients,every patient's teeth were divided into two groups according to randomized control trial design as non-drug therapy (only SPR) and drug therapy (after SPR putting minocycline hydrochloride into periodontal pocket). To measure the Index at baseline before SPR. 1 and 3 months after SPR or SPR and drug treatment,subgingival plaque samples were collected and detected and quantified by the measurements of TaqMan Real-time PCR. To analyze the data using SPSS 11.5 software.Results(1)Constitution ratio of Pg of the two groups: before the treatment,the data of two groups were 68%; after treatment 1 month the SPR group was 30%,SPR with minocycline was 28%,3 month the SPR group was 24%,SPR with minocycline was 22%,after treatment 1 month and 3 month were reduced comparing with the one before treatment,the result was statistically significant (P<0.05). Constitution ratio of Pg of the two groups after treatment 3 month was below the one of 1 months after treatment,the result was no statistically significant (P>0.05). Constituent ratio of Pg between the two groups showed no difference before and after the treatment 1 and 3 mouths,the result was no statistically significant (P>0.05).(2)The relationship between constituent ratio of Pg and the clinical index such as PD,BI and AL showed positive correlation,the result was statistically significant (P<0.05).ConclusionPeriodontal disease which is treated by SPR treatment or SPR with minocycline hydrochloride will reduce the number of Pg in subgingival plaque,and can maintain a therapeutic effect in three months. the SRP treatment plays a critical role and the improvement of clinical treatment effect using minocycline hydrochloride shows no obvious.

porphyromonas gingivalis (Pg); real-time quantitation PCR; minocycline

10.11724/jdmu.2013.06.23

R781.404

A

1671-7295(2013)06-0603-04

萬君，李秋紅，王如，等. 米諾環(huán)素輔助治療牙周炎前后牙齦卟啉單胞菌的定量檢測[J].大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2013,35(6)：603-606.

萬 君(1971-)，女，遼寧撫順人，主治醫(yī)師。E-mail：wj-826@163.com

李秋紅，副教授。E-mail:dlliqiuhong@126.com

2013-06-27；

2013-09-05)