王維維，趙 亮，位曉三

宿州學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，安徽宿州，234000

太湖新銀魚(yú)(NeosalanxtaihuensisChen)又名太湖短吻銀魚(yú)，中國(guó)特有種[1]，隸屬銀魚(yú)科(Salangidae)新銀魚(yú)屬(Neosalanx)，是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)魚(yú)類[2]。

近年來(lái)，太湖新銀魚(yú)資源量大量下降，大多數(shù)銀魚(yú)的原產(chǎn)地已失去漁業(yè)價(jià)值，因此銀魚(yú)科魚(yú)類資源亟待加以保護(hù)[3]。太湖新銀魚(yú)線粒體Cytb基因的研究對(duì)于研究銀魚(yú)種群的遺傳多樣性、遺傳結(jié)構(gòu)及種群歷史動(dòng)態(tài)等方面具有重要的意義。太湖新銀魚(yú)Cytb基因?yàn)榫€粒體基因組中進(jìn)化較快的片段，具有分子量小、分子結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、母系遺傳和進(jìn)化速度快等特點(diǎn)，尤其是線粒體所編碼的Cytb基因，被認(rèn)為是探討系統(tǒng)進(jìn)化和分類研究的良好指標(biāo)，有較強(qiáng)的適用性，已在多種動(dòng)物類群的系統(tǒng)發(fā)育中得到了有效的應(yīng)用[4-6]。本文采用正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，對(duì)太湖新銀魚(yú)線粒體Cytb基因擴(kuò)增的條件進(jìn)行優(yōu)化。采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，用較少的處理組合研究較多的實(shí)驗(yàn)因素，大量節(jié)約了實(shí)驗(yàn)時(shí)間。最終對(duì)結(jié)果進(jìn)行方差分析，摸索出高效的太湖新銀魚(yú)線粒體Cytb基因PCR擴(kuò)增條件，可以為太湖新銀魚(yú)的進(jìn)一步研究提供一定的技術(shù)基礎(chǔ)，具有重要的理論和實(shí)踐意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)樣本為淮河流域太湖新銀魚(yú)個(gè)體，所采集的樣本清洗后置于250 mL采樣瓶中，加入適量的95%乙醇保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

dNTPs、10×PCR buffer(15 pmol/μL Mg2+plus)、Taq DNA聚合酶均為北京全式金生物科技有限公司公司生產(chǎn)，DNA Marker(DL2000)為T(mén)akara公司產(chǎn)品，其余的化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.3 儀器設(shè)備

凝膠成像系統(tǒng)Tanon(天能公司GIS-2008型)、臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(SIGMA 1-15k型)、普通冰箱(格力)、微波爐(格蘭仕)、PCR 擴(kuò)增儀(TL-512)、電泳系統(tǒng)(BIO RAD伯樂(lè)公司 PAC300)、純水儀(MICLIPORE Elix系列)、小型高速離心機(jī)(Hema TGL-16H，上海安亭TGL-16C)、高壓滅菌鍋(HIRAYA HVE-50)、恒溫水浴鍋(Grant GA100)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 基因組DNA的提取

將100～300 mg太湖新銀魚(yú)背部肌肉剪碎后置入500～700 μL裂解緩沖液中，靜置30 min，采用氯仿抽提法[7]進(jìn)行DNA的提取。取4 μL總DNA產(chǎn)物，在120 V電壓下電泳40 min。電泳結(jié)束后，在紫外投射分析儀下觀察結(jié)果，并使用凝膠成像系統(tǒng)拍照。DNA樣品置于-20℃中保存。

1.4.2 引物設(shè)計(jì)

用引物設(shè)計(jì)軟件Oligo6自行設(shè)計(jì)太湖新銀魚(yú)線粒體Cytb基因擴(kuò)增引物。經(jīng)篩選獲得有效擴(kuò)增引物：前端擴(kuò)增引物為L(zhǎng)14321，即5′-CAGTGACTTG AAAAACCACCG-3′，后端擴(kuò)增引物為H15634，即5′-CTTAGCTTTGGGAGTTAAGGG-3′。

1.4.3 PCR擴(kuò)增

采用五因素四水平正交實(shí)驗(yàn)[8]設(shè)定不同的擴(kuò)增條件，觀察體系中引物濃度、Taq酶濃度、dNTPs濃度、基因組模板濃度、退火溫度對(duì)擴(kuò)增結(jié)果的影響，選擇最佳的PCR擴(kuò)增條件。擴(kuò)增條件的正交設(shè)計(jì)方案如表1，每個(gè)方案重復(fù)3次，反應(yīng)擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min，30個(gè)循環(huán)每個(gè)循環(huán)包括94℃變性30 s，不同退火溫度退火60 s，72℃延伸2 min，72℃延伸5 min，將PCR產(chǎn)物置于4℃冰箱中保存。

表1 PCR擴(kuò)增條件正交設(shè)計(jì)表L16(45)

1.4.4 PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)

取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，在1%瓊脂糖凝膠上電泳，DL2000 Marker作為標(biāo)準(zhǔn)。在紫外投射分析儀下觀察擴(kuò)增結(jié)果，并使用凝膠成像系統(tǒng)拍照備份。檢測(cè)不同擴(kuò)增條件下擴(kuò)增出的條帶形狀及亮度，采用直觀分析法對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行評(píng)分。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA電泳結(jié)果

將基因組DNA的提取產(chǎn)物經(jīng)含0.05% green Ⅰ的1%瓊脂糖凝膠電泳在凝膠成像儀上觀察,只選取重復(fù)性好、電泳清晰的譜帶用于PCR。經(jīng)過(guò)分析，第六條帶結(jié)果最好，如圖1，M為DL2000 Marker Plus Ⅱ。

圖1 基因組電泳結(jié)果

2.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果

按照正交設(shè)計(jì)方案設(shè)定的16個(gè)處理組合進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將產(chǎn)物電泳的結(jié)果，參照何正文等的正交直觀分析[8]方法，將條帶最亮、帶形規(guī)則的擴(kuò)增結(jié)果計(jì)為10分，未擴(kuò)增出結(jié)果或出現(xiàn)多條擴(kuò)增條帶的非特異性結(jié)果計(jì)為1分，其他條帶根據(jù)條帶的強(qiáng)弱和雜帶的多少分別打分，結(jié)果如下，第1次重復(fù)的分值為1～16：5，10，8，2，3，7，6，3，8，4，1，1，6，9，1，1；第2次重復(fù)的分值為1～16：4，10，7，3，5，7，5，4，8，8，1，1，7，8，1，1；第3次重復(fù)的分值為1～16：5，10，8，3，3，6，5，3，8，4，1，1，7，9，1，2。3次重復(fù)結(jié)果相差較小，趨于一致，圖2為第1次重復(fù)的電泳結(jié)果圖，1～16泳道分別代表相應(yīng)的處理組合，M表示DL-2000 Marker。16個(gè)處理組合的記分結(jié)果如上。

圖2 PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.3 方差分析

將評(píng)分結(jié)果用正交設(shè)計(jì)助手[9]軟件進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表2和圖3效應(yīng)曲線圖，F(xiàn)比與臨界值比較可知：dNTPs濃度對(duì)擴(kuò)增結(jié)果影響最大，達(dá)極顯著水平；Taq酶濃度對(duì)擴(kuò)增結(jié)果影響最小，不顯著；退火溫度、引物濃度對(duì)擴(kuò)增結(jié)果也存在影響，達(dá)顯著水平。在一定濃度范圍內(nèi)，隨dNTPs濃度增加，擴(kuò)增條帶亮度增加，但高于一定濃度后，條帶亮度降低。退火溫度過(guò)高，條帶特異性強(qiáng)，但亮度較弱，退火溫度過(guò)低，非特異性反應(yīng)增強(qiáng)，這可能是因?yàn)橥嘶饻囟鹊?，單引物隨機(jī)擴(kuò)增增強(qiáng)，退火溫度過(guò)高，引物與模板結(jié)合差，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物豐度下降。擴(kuò)增條帶亮度受體系中模板濃度影響較小，這可能是因?yàn)闂l帶亮度主要受PCR擴(kuò)增產(chǎn)物富集影響，在低于閥值的范圍內(nèi)，產(chǎn)物亮度與循環(huán)數(shù)成正比，在適宜的模板濃度范圍內(nèi)，高模板濃度與低模板濃度效果一致。

表2 方差分析表

圖3 效應(yīng)曲線圖

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)研究了Taq酶濃度、退火溫度、引物濃度、dNTPs濃度和模板濃度對(duì)PCR擴(kuò)增結(jié)果的影響，結(jié)果表明：引物濃度、退火溫度對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響較大，達(dá)顯著水平；模板濃度、Taq酶濃度對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響較小，不顯著；dNTPs濃度是影響PCR反應(yīng)最顯著的因素，dNTPs濃度過(guò)高可能會(huì)產(chǎn)生錯(cuò)誤摻入，而濃度過(guò)低會(huì)降低產(chǎn)量，反復(fù)凍融使之活性降低，甚至出現(xiàn)假陰性結(jié)果，本試驗(yàn)最佳濃度為2.5 mmol/L。

本文摸索出了適合太湖新銀魚(yú)線粒體Cytb基因的最優(yōu)反應(yīng)體系，即25 μL的反應(yīng)體系中，在退火溫度為50℃、引物濃度為0.5 umol/L、Taq酶濃度為2.5 U/μL、模板濃度為5 ng/μL、dNTPs濃度為2.5 mmol/L的條件下，太湖新銀魚(yú)線粒體Cytb基因擴(kuò)增效果為最佳，電泳條帶清晰、規(guī)則。此結(jié)果對(duì)進(jìn)一步研究太湖新銀魚(yú)種群的遺傳多樣性、遺傳結(jié)構(gòu)及種群歷史動(dòng)態(tài)等方面具有重要的意義。

參考文獻(xiàn)：

[1]XIE Yu-hao,XIE Han.Classification,Distribution,and Popu-lation Ecology Salangdae Fishes[J].Chinese Journal of Fish-eries,1997,10(2):11-19

[2]ZHANG Yu-ling.A Taxonomic Study on the Chinese Icefishes of the GenusNeo salanx(Pisces:Salangidae) with Description of a New Species form the Lake Taihu[J].Zoological Research,1987,8(3):227-286

[3]ZHAO Liang,XIE Ben-Gui,LIU Zhi-Jin,et al.Molecular Structure and DNA Substitution Rate of the Mitochondrial Control Region and Cytochrome b in Taihu Salangid，Neosalanx taihuensis[J].Chinese Journal of Zoology,2010,45(2):27-38

[4]Tanaka-Ueno T,Matsui M,Sato T,et al,Phylogenetic relationships of brown frogs with 24 chromosomes from Far East Russia and Hokkaido assessed by mitochondrial cytochromeb gene sequences[J].Zoo Sci,1998,15(1):289-294

[5]Briolay J,Galtier N,Brito RM,et al.Molecular phylogeny ofcyprinidae inferred from cytochrome b DNA sequences[J].Mol Phylogenet,1998,9(1):100-108

[7]張民照.總DNA的抽提及其PCR分析條件[J].動(dòng)物學(xué)研究,2001,22(1):20-26

[8]何正文,劉運(yùn)生,陳立華,等.正交設(shè)計(jì)直觀分析法優(yōu)化PCR條件[J].湖南醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1998,23(4):403-404

[9]曾濤,宋國(guó)際.“正交設(shè)計(jì)助手”軟件在銀鏡反應(yīng)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用[J].化學(xué)教學(xué),2005,5(5):50-51