詹海濤,吳劍峰,李海燕,孟紅旗,曾煦欣

(佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院 臨床醫(yī)學(xué)系,廣東 佛山 528000)

缺血性卒中發(fā)作前給予預(yù)適應(yīng)藥物,使腦組織處于預(yù)適應(yīng)狀態(tài),產(chǎn)生保護(hù)作用,對(duì)于防治急性缺血性腦血管病,具有顯著的有效性。本研究應(yīng)用大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)模型大鼠,觀察香港遠(yuǎn)志(Polygala hongkongensis)黃酮苷預(yù)處理,對(duì)大鼠神經(jīng)行為缺損評(píng)分(NBDS)、腦梗死體積(IV)、血清神經(jīng)元烯醇化酶(NSE)、腦組織轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(T GF-β)和熱休克蛋白70(HSP70)含量的影響,為臨床應(yīng)用提供研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 香港遠(yuǎn)志黃酮苷的提取、分離與鑒定

香港遠(yuǎn)志藥材采自廣東,采用硅膠、Sephadex LH-20、半制備高效液相色譜等技術(shù),對(duì)香港遠(yuǎn)志全株的70%甲醇提取物進(jìn)行分離純化,運(yùn)用紅外光譜(IR)、紫外光譜(UV)、質(zhì)譜(HRESI-MS、ESI-M S)及核磁共振光譜 (1H NM R、 13C NMR、 DEPT、 1H-1HCOSY、 HMQC、 HMBC、NOESY)等波譜學(xué)技術(shù) ,鑒定出單體化合物:山柰酚-3-0-葡萄糖苷(PHN-08)、山柰酚-3-0-蕓香糖苷(PHN-11)。

1.2 動(dòng)物分組及給藥

體質(zhì)量280～ 300 g雄性SD大鼠(廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供),隨機(jī)分5組,假手術(shù)組、模型組和干預(yù)組(PHN-08組、PHN-11組及合方組),每組28只。將 PHN-08、PHN-11制備成2種注射液,每mL分別含 PHN-0812 mg及 PHN-1116 mg,合方為上述 2種組分以單組分含量等比混合。MCAO前1周給藥,生理鹽水稀釋按每天 4 m L/kg腹腔注射,每天1次,假手術(shù)組、模型組按相同方式給等量生理鹽水。各組大鼠室溫下自由進(jìn)食、進(jìn)水,在設(shè)定時(shí)間測(cè)定相關(guān)指標(biāo)。

1.3 MCAO模型制備

線栓法[1]制備MCAO模型,加熱直徑0.20 mm尼龍線頂端,制成直徑為0.25 mm光滑球狀,10%水合氯醛腹腔注射麻醉(350 mg/kg),頸部縱行切口,分離右側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)、頸內(nèi)脈(ICA)、頸外動(dòng)脈(ECA),結(jié)扎CCA近心端及 ECA近分叉部,充分游離 ICA。沿ICA方向插入頂端直徑0.25 mm尼龍線至有阻力為止(約 20 mm),于近心端結(jié)扎 ICA。動(dòng)物蘇醒后左側(cè)肢體偏癱為造模成功,假手術(shù)組不插線栓,余操作同上。

1.4 相關(guān)指標(biāo)測(cè)定

(1)神經(jīng)行為缺損評(píng)分(neurological behavior deficits scores,NBDS)測(cè)定。各組隨機(jī)取12只大鼠,采用 Longa等[2]評(píng)分法,評(píng)估 MCAO后 24 h的 NBDS。 0分,正常;1分,左側(cè)前肢內(nèi)旋、內(nèi)收;2分,行走向左側(cè)轉(zhuǎn)圈;3分,行走向左側(cè)傾倒;4分,無自主活動(dòng)。

(2)腦梗死體積(IV)百分比測(cè)定。 NBDS后即斷頭取腦,置-20°C冰箱冷凍 10 min,從大腦半球額極至枕極連續(xù)冠狀切6片(片厚2 mm),置 2%的 T TC溶液(37°C)中避光孵育30 min,正常組織呈紅色,梗死區(qū)呈白色,用圖像分析軟件處理。每只動(dòng)物梗死體積為腦片梗死面積乘以厚度(2mm)后之和。為校正腦水腫偏差,IV(%)=(手術(shù)對(duì)側(cè)正常大腦體積-手術(shù)同側(cè)正常體積)/手術(shù)對(duì)側(cè)正常大腦體積×100%。

(3)血清神經(jīng)元烯醇化酶(NSE)測(cè)定。NBDS后即斷頭取血,標(biāo)本3000 r/min離心3 min,血清置-20°C冰箱待測(cè)。應(yīng)用NSE-ELISA法測(cè)定血清NSE含量,試劑盒由北京北方生物技術(shù)研究所提供,按說明書要求操作測(cè)定 (單位:ng/mL)。

(4)TGF-β、HSP70測(cè)定。分別于 MCAO后 12 h及 24 h,各組隨機(jī)取 8只大鼠,斷頭處死,置冰盤速取缺血側(cè)大腦紋狀體和皮層組織,加冰生理鹽水(2.5 mL/g),冰浴勻漿后置4°C離心機(jī)中,3500 r/min離心15 min,取上清液置-20°C冰箱備測(cè)。酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)TGF-β(ng/L)、HSP70(μ g/L)含量(TGF-β和 HSP70定量 EIA Kit分別購自上海森雄實(shí)業(yè)有限公司及北京欣圣榮公司,按說明書操作要求測(cè)定)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行分析,數(shù)據(jù)以x±s表示,兩樣本間比較用t檢驗(yàn),多組間比較采用方差分析,P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NBDS測(cè)定

假手術(shù)組無神經(jīng)行為缺損,模型組與干預(yù)組出現(xiàn)神經(jīng)行為缺損。與模型組比較,干預(yù)組NBDS顯著減低(PHN-08組及 PHN-11組 P＜0.05,合方組 P＜0.01),如表1所示。

表1 香港遠(yuǎn)志黃酮苷對(duì)局灶性腦缺血大鼠 NBDS、IV、N SE影響(±s)

表1 香港遠(yuǎn)志黃酮苷對(duì)局灶性腦缺血大鼠 NBDS、IV、N SE影響(±s)

注:與假手術(shù)組比較:*P＜0.01;與模型組比較:△P＜0.05,△△P ＜0.01。

組別 n NBDS IV/% N SE/(ng· mL-1)假手術(shù)組 12003.96±0.79模型組 123.41± 0.7031.96± 5.288.97± 2.15*PHN-08組 122.90± 0.41△ 27.63± 4.72△ 7.18±1.94*△PHN-11組 122.85± 0.36△ 26.92± 4.05△ 6.91±1.73*△合方組 122.66±0.32△△ 26.01±3.84△△ 6.54±1.25*△△

2.2 IV百分比測(cè)定

假手術(shù)組無梗死灶,模型組與干預(yù)組右側(cè)額頂葉、尾狀核與殼核外側(cè)部出現(xiàn)梗死灶。與模型組比較,干預(yù)組 IV顯著減小(PHN-08組及 PHN-11組 P＜0.05,合方組 P＜0.01),如表1所示。

2.3 NSE測(cè)定

模型組及干預(yù)組的 NSE含量顯著高于假手術(shù)組(P＜0.01),干預(yù)組顯著低于模型組(PHN-08組及PHN-11組 P＜0.05,合方組 P＜0.01),如表1所示。

2.4 TGF-β測(cè)定

腦缺血12 h,模型組及干預(yù)組TGF-β含量顯著高于假手術(shù)組(模型組、PHN-11組P＜0.05,PHN-08組、合方組P＜0.01),與模型組比較,PHN-08組、合方組含量顯著增高(P＜0.05)。腦缺血24 h,模型組及干預(yù)組 TGF-β含量較假手術(shù)組顯著增高(P＜0.01),與模型組比較,干預(yù)組含量顯著增高(P＜0.05),如表2所示。

2.5 HSP70測(cè)定

腦缺血12 h,模型組及干預(yù)組HSP70含量較假手術(shù)組顯著增高(P＜0.01),模型組與干預(yù)組間含量無顯著性差異。腦缺血 24 h,模型組及干預(yù)組 HSP70含量較假手術(shù)組顯著增高(P＜0.01),與模型組比較,干預(yù)組含量顯著增高(PHN-08組、PHN-11組P＜0.05,合方組 P＜0.01),如表2所示。

表2 香港遠(yuǎn)志黃酮苷對(duì)局灶性腦缺血大鼠腦組織 TGF-β、HSP70含量影響(±s)

表2 香港遠(yuǎn)志黃酮苷對(duì)局灶性腦缺血大鼠腦組織 TGF-β、HSP70含量影響(±s)

注:與假手術(shù)組比較:*P＜0.05,**P＜0.01;與模型組比較:△P＜0.05,△△P ＜0.01。

組別 n TGF-β/(ng· L-1)HSP70/(μg· L-1)腦缺血 12h 腦缺血24h 腦缺血 12h 腦缺血 24h假手術(shù)組 81.63± 0.711.68± 0.6370.63± 7.9165.38± 7.41模型組 82.59± 0.83* 14.19± 3.58** 121.47± 37.08** 127.83± 41.72**PHN-08組 83.52±0.87**△ 18.39±4.16**△ 138.20±40.13** 175.31± 46.25**△PHN-11組 82.50±0.79* 18.63± 4.31**△ 158.32±47.01** 180.16± 43.54**△合方組 83.57±0.85**△ 19.67± 3.81**△ 153.91±45.74** 194.27± 45.18**△△

3 討論

藥理性預(yù)適應(yīng)(pharmacological preconditioning)通過預(yù)先激活機(jī)體內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制,發(fā)揮對(duì)腦組織的保護(hù)作用,其防治急性缺血性腦血管病的有效性,已成為近年國內(nèi)、外的研究熱點(diǎn)[1-2]。但開發(fā)療效理想的預(yù)適應(yīng)藥物,仍需大量深入的藥物篩選研究,在此領(lǐng)域,植物藥具有獨(dú)特的開發(fā)應(yīng)用前景。遠(yuǎn)志屬的多種植物在我國應(yīng)用普遍且藥效多樣,其安神益智作用,在文獻(xiàn)古籍、經(jīng)方記載中出現(xiàn)頻率較高,現(xiàn)代藥理研究表明其具有提高學(xué)習(xí)記憶力、腦保護(hù)和抗癡呆作用。香港遠(yuǎn)志(Polygala hongkongensis)系遠(yuǎn)志科(Polygalaceae)遠(yuǎn)志屬植物,在民間以全草入藥,具有活血、化瘀、解毒之功效[3]。本研究首次選用香港遠(yuǎn)志,觀察其有效組分黃酮苷 (PHN-08、PHN-11)對(duì) MCAO模型大鼠,NBDS、IV、NSE、TGF-β和HSP70含量的影響,探究其腦神經(jīng)保護(hù)作用與作用機(jī)制。

NBDS、IV與 NSE可分別從功能學(xué)、形態(tài)學(xué)及血液生化等方面,反映急性缺血性腦損傷的嚴(yán)重程度。本研究顯示,假手術(shù)組大鼠未出現(xiàn)神經(jīng)行為缺損及梗死灶形成,模型組與干預(yù)組均出現(xiàn)不同程度神經(jīng)行為缺損及梗死灶,血清NSE含量較假手術(shù)組顯著增高。提示由于 MCAO引發(fā)的神經(jīng)元損傷、梗死灶形成,導(dǎo)致顯著的神經(jīng)功能障礙。與模型組比較,各干預(yù)組的NBDS、IV、NSE有顯著性改善,其中合方組改善更加顯著,表明香港遠(yuǎn)志黃酮苷預(yù)處理,對(duì)MCAO大鼠急性腦損傷產(chǎn)生良好的保護(hù)作用。

T GF-β由活化的 T細(xì)胞和單核 /巨噬細(xì)胞產(chǎn)生,其中 TGF-β1在缺血性腦損傷時(shí),發(fā)揮顯著的多靶點(diǎn)腦保護(hù)功能。研究顯示,TGF-β1可通過刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)和腦元性神經(jīng)生長(zhǎng)因子(BDNF),促進(jìn)神經(jīng)元的存活和分化[4-5],T GF-β1可促進(jìn)體外培養(yǎng)原代小腦神經(jīng)元樹突生長(zhǎng)及促進(jìn)突觸素1表達(dá)的增多[6]。本研究顯示,腦缺血12 h,模型組及干預(yù)組 TGF-β含量顯著高于假手術(shù)組,隨時(shí)間推移,至腦缺血 24 h呈進(jìn)一步增高趨勢(shì),可能與腦組織損傷程度隨時(shí)間推移不斷加重相關(guān)。與模型組比較,腦缺血 12 h,PHN-08組、合方組的含量顯著增高;腦缺血24 h,各干預(yù)組的含量均顯著上升。這表明香港遠(yuǎn)志黃酮苷對(duì)MCAO大鼠急性腦損傷的保護(hù)作用,可能通過單體化合物或(和)有效組分協(xié)同作用,調(diào)控 TGF-β的表達(dá),發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng),且各效組分調(diào)控作用有時(shí)序性差異。

HSP70主要由中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生,生理狀態(tài)下其含量很低,當(dāng)細(xì)胞受熱或化學(xué)應(yīng)激時(shí)表達(dá)增加。腦缺血損傷時(shí),谷氨酸攝氧功能降低,興奮性氨基酸堆積導(dǎo)致神經(jīng)元損傷,可使HSP70表達(dá)增高。研究發(fā)現(xiàn) HSP70具有保護(hù)腦細(xì)胞、增強(qiáng)抗損傷、促進(jìn)腦細(xì)胞修復(fù)等作用[7]。本研究顯示,腦缺血12h,模型組及干預(yù)組的HSP70含量已顯著高于假手術(shù)組,至腦缺血24h,呈進(jìn)一步增高趨勢(shì),表明 HSP70的表達(dá)與腦損傷的程度及持續(xù)時(shí)間相關(guān)。腦缺血 12 h,模型組與各干預(yù)組間的HSP70含量無顯著性差異,提示香港遠(yuǎn)志黃酮苷此時(shí)段未發(fā)揮生物效應(yīng)。腦缺血24 h,與模型組比較,各干預(yù)組的HSP70均有顯著表達(dá),其中合方組效應(yīng)最強(qiáng)。單一組分與組分配伍間的效果差異,或許因組分配伍后造成藥物特性或藥物作用環(huán)境改變所致。表明香港遠(yuǎn)志黃酮苷可能通過促進(jìn) HSP70的表達(dá),對(duì)MCAO大鼠急性腦損傷發(fā)揮保護(hù)作用,且與損傷持續(xù)時(shí)間、嚴(yán)重程度及有效組分的協(xié)同作用等有關(guān)。

本研究結(jié)果表明,香港遠(yuǎn)志有效組分黃酮苷預(yù)處理,對(duì)局灶性腦缺血模型大鼠具備腦保護(hù)作用,其作用機(jī)制可能是增強(qiáng) TGF-β和 HSP70的表達(dá),延緩或阻止缺血后神經(jīng)元死亡進(jìn)程,防止梗死灶擴(kuò)大、改善神經(jīng)行為缺損,從而顯示出有效的藥理性預(yù)適應(yīng)作用。新近的研究證實(shí)[8-10],香港遠(yuǎn)志有效成分具有抗氧化、抑制凋亡基因表達(dá)作用。更為明確的作用機(jī)制,有待進(jìn)一步研究TGF-β和HSP70的高表達(dá)與抗氧化、抑制凋亡基因的相互關(guān)系;有效組分間的協(xié)同作用、療效的時(shí)序性以及是否影響其他遞質(zhì)或分子。

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