周朝東，黃哲甦

(天津市藥品檢驗所，天津 300070)

眼氨肽滴眼液系由牛、羊或豬等動物眼為原料，經(jīng)乙醇提取后加適量的防腐劑制成的滴眼液。該制劑含有多種氨基酸(主要為谷氨酸、丙氨酸、甘氨酸、纈氨酸、亮氨酸及賴氨酸)、多肽、核苷酸及鈉、鉀、鈣、鎂等微量元素。該制劑具有激活酶的功能，激活肌體防御系統(tǒng)，增強防御功能，并能減輕或阻斷其病理過程，促進眼組織的新陳代謝、傷痕愈合和吸收炎癥滲出，并能促進眼角膜上皮組織的再生［1］，臨床上用于角膜炎、視力疲勞及青少年假性近視等。根據(jù)《中國藥典》2010年版的要求，滴眼液中可加入適宜濃度的抑菌劑，以保證在使用期間能夠抑制細菌的生長與繁殖，保證用藥過程的安全性，但過量抑菌劑對人體也會產(chǎn)生毒害作用。目前有部分企業(yè)在眼氨肽滴眼液中加入醋酸氯己定作為抑菌劑。醋酸氯己定又稱醋酸洗必泰，對革蘭陽性菌和陰性菌的抗菌作用強，對真菌有效，常用于器械、皮膚及黏膜的消毒［2］。本實驗參考相關(guān)文獻［3，4］，建立高效液相色譜的方法對眼氨肽滴眼液中醋酸氯己定進行含量測定，以便于對眼氨肽滴眼液中醋酸氯己定含量進行控制，保證藥品的安全性。

1 儀器與試藥

島津LC2010A 高效液相色譜儀，CLASS -VP 色譜工作站;METTlER TOLEDO xs205 型十萬分之一電子天平;醋酸氯己定對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號為100183 -201003);眼氨肽滴眼液(市售品，批號為120101、101101、111106);乙腈為色譜純，其余試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱:welch materials AQ - C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為0.02 mol/L 磷酸二氫鉀(磷酸調(diào)節(jié)pH 至2.5)-乙腈(70∶ 30 )，流速為1.0 ml/min，柱溫為40 ℃，檢測波長為254 nm，進樣量20 μl;理論板數(shù)按醋酸氯己定峰計算，不少于4000，與相鄰峰分離度符合要求。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取醋酸氯己定對照品適量，加流動相溶解并稀釋至每1 ml 含0.1 mg 的溶液，搖勻，作為對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取供試品直接進樣分析。

2.2.3 陰性對照溶液的制備 取不含抑菌劑醋酸氯己定的供試品溶液進樣分析。分別取對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，結(jié)果見圖1。

圖1 對照品(A)陰性對照(B)供試品(C)HPLC 色譜圖

2.3 方法學考查

2.3.1 線性關(guān)系考查 精密稱取醋酸氯己定對照品約10 mg 置10 ml 量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻。分別精密量取0.5、0.75、1、1.25 和1.5 ml置10 ml 量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻。分別精密量取20 μl 注入液相色譜儀進行分析。以濃度對峰面積進行線性回歸，回歸方程為A =58 357 653 C-52 212，(r=0.9999，n =5)。結(jié)果表明，醋酸氯己定濃度在0.05 ～0.15 mg/ml 范圍內(nèi)與其峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.3.2 精密度試驗 取醋酸氯己定對照品溶液20 μl，連續(xù)進樣5 次。按上述色譜條件測定，結(jié)果峰面積RSD 為0.25%(n=5)，表明儀器精密度良好。

2.3.3 檢出限和定量限 精密稱取醋酸氯己定對照品約10 mg，置50 ml 容量瓶中，用流動相溶解并稀釋至刻度，然后進行系列稀釋，以信噪比S/N=3∶ 1 作為檢出限，其檢出限為0.26 ng，以信噪比S/N=10∶ 1 作為定量限，定量限為0.52 ng。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗 取對照品溶液，分別在0、3、6、12和24 h 進樣。結(jié)果峰面積的RSD 為0.26%(n =5)，表明醋酸氯己定在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5 加樣回收試驗 精密稱取醋酸氯己定對照品約25 mg，置25 ml 量瓶中，用流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密量取1 ml 置10 ml 量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液。然后分別精密量取0.8、1.0 和1.2 ml 各3 份，分別置10 ml 量瓶中，用不含醋酸氯己定的眼氨肽滴眼液供試品溶液稀釋至刻度，搖勻。精密量取20 μl 注入液相色譜儀，記錄色譜圖。按外標法以峰面積計算含量，結(jié)果平均回收率為99.84%，RSD 為0.42%，見表1。

表1 加樣回收試驗結(jié)果

2.4 供試品含量測定 對3 批樣品按上述色譜條件進行含量測定，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果

3 討論

醋酸氯己定具有較強的抑菌、殺菌作用，主要通過破壞細菌胞漿膜的滲透屏障，使細菌的生長繁殖受到抑制和破壞而產(chǎn)生抗菌作用［5］。滴眼液中加入醋酸氯己定可以有效地抑制滴眼液在頻繁開啟使用中細菌的生長和繁殖，保證用藥過程中的安全性。本法參考其他文獻資料，選用welch materials AQ -C18色譜柱，采用磷酸鹽和乙腈比例為70∶ 30 的流動相，在此色譜條件下醋酸氯己定的理論板數(shù)約為5000，峰形較好，保留時間約為8.5 min，能夠與相鄰的未知峰達到有效的分離，并且分析時間也很合適。此外利用本法對眼氨肽滴眼液中的防腐劑醋酸氯己定進行了方法學的研究并進行了含量測定，結(jié)果良好。最后利用本法測定滴眼液中防腐劑醋酸氯己定，方法簡單、快捷及重復性好，適用于滴眼液中醋酸氯己定的含量測定。

1 陳新謙. 新編藥物學［M］. 第14 版. 北京:人民衛(wèi)生出版社，1998:599

2 唐健. 醋酸氯己定栓劑的制備及質(zhì)量控制［J］. 中南醫(yī)學科學雜志，2011，39(2):227

3 周燕飛. HPLC 法測定醋酸氯己定子宮灌注液的含量［J］. 中國獸藥雜志，2010，44(5):31

4 盧素格，劉紅麗，楊瑞春. 高效液相色譜測定皮膚消毒液中醋酸氯己定的含量［J］. 中國消毒學雜志，2011，28(3):317

5 雍德卿.新編實用醫(yī)院制劑注釋［M］.第2 版. 北京:人民衛(wèi)生出版社，2004:139 -140