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(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬青島市市立醫(yī)院病理科，山東 青島 266071)

肺癌是全球死亡率最高的惡性腫瘤之一，大多數(shù)病人確診時已到中晚期，失去手術(shù)機(jī)會，化療是主要的治療手段[1]。多藥耐藥(MDR)是導(dǎo)致肺癌治療失敗的主要原因之一，嚴(yán)重影響了病人的化療效果和生存率。本文采用免疫組織化學(xué)方法檢測63例肺癌組織中P-糖蛋白(P-gp)、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶Ⅱ(GST-Ⅱ)及DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶(TOPO-Ⅱ)的表達(dá)，探討它們與細(xì)胞核增殖抗原(Ki-67)的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本

收集我院病理科2011年1月—2012年3月因肺癌行手術(shù)切除標(biāo)本63例，術(shù)前均未行放療及化療。男41例，女22例；年齡35～83歲，中位年齡58歲；腫瘤直徑≤3 cm 者30例，> 3 cm者 33例；組織學(xué)類型(WHO分類)：鱗癌21例，腺癌24例，小細(xì)胞肺癌12例，大細(xì)胞癌6例；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移19例，癌轉(zhuǎn)移到附近或遠(yuǎn)處淋巴結(jié)及其他組織器官44例；病理學(xué)分級：中、高分化30例，低分化33例；有吸煙史者36例，無吸煙史者27例。所有標(biāo)本均經(jīng)40 g/L甲醛固定，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，常規(guī)蘇木精-伊紅染色。

1.2 免疫組織化學(xué)檢測

采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)法(SP法)分別進(jìn)行檢測，P-gp和GST-Ⅱ、TOPO-Ⅱ和Ki-67一抗及SP試劑盒均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司。嚴(yán)格按照試劑盒說明書步驟進(jìn)行操作，用已知陽性肝癌切片作陽性對照，以磷酸鹽緩沖液(PBS)替代一抗作陰性對照。

1.3 結(jié)果判定

光學(xué)顯微鏡下以胞核、胞膜、胞漿中存在棕黃色顆粒為陽性，其中P-gp的陽性顆粒主要分布于胞質(zhì)和(或)胞膜，GST-Ⅱ的陽性顆粒主要分布于胞核和(或)胞質(zhì)，TOPO-Ⅱ和Ki-67的陽性顆粒分布于胞核。根據(jù)染色程度和染色陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)進(jìn)行評分[2]。按染色程度:不著色計為0分，淡黃色計為1分，黃色計為2分，棕褐色計為3分。按染色陽性細(xì)胞所占百分比: 著色陽性細(xì)胞占計數(shù)細(xì)胞<5%計為0分，5%～25% 計為1分，26%～50%計為2分，>50%計為3分。將二者評分相乘，0～3分者為陰性，≥4分者為陽性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用卡方檢驗法分析P-gp、GST-Ⅱ、TOPO-Ⅱ、Ki-67表達(dá)與其臨床病理特征之間的關(guān)系，應(yīng)用Spearman等級相關(guān)分析P-gp、GST-Ⅱ、TOPO-Ⅱ與Ki-67的相關(guān)性。

2 結(jié) 果

2.1 P-gp、GST-Ⅱ、TOPO-Ⅱ和 Ki-67蛋白表達(dá)與肺癌臨床病理特征的關(guān)系

P-gp、GST-Ⅱ、TOPO-Ⅱ和Ki-67在肺癌組織中的陽性表達(dá)率分別為61.9%、63.5%、77.8%和39.7%。P-gp、GST-Ⅱ在非小細(xì)胞癌組織的陽性表達(dá)率明顯高于小細(xì)胞癌(χ2=8.561、9.475,P<0.01)。中高分化癌組織中GST-Ⅱ的陽性表達(dá)率明顯高于低分化癌組織(χ2=6.733,P<0.01)。TOPO-Ⅱ在鱗癌和小細(xì)胞癌組織中的陽性表達(dá)率明顯高于腺癌(χ2=8.259、4.189,P<0.01、0.05)。Ki-67在小細(xì)胞癌組織中的陽性表達(dá)率明顯高于非小細(xì)胞癌(χ2=22.532,P<0.01)，在低分化癌組織的陽性表達(dá)率明顯高于中高分化組織(χ2=9.270,P<0.01)。P-gp、GST-Ⅱ、TOPO-Ⅱ、Ki-67的陽性表達(dá)率與肺癌病人的年齡、性別、是否有吸煙史、腫瘤的大小以及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等因素均無相關(guān)性(P>0.05)。見表1。

表1 P-gp、GST-Ⅱ、TOPO-Ⅱ、Ki-67蛋白表達(dá)與肺癌臨床病理特征的關(guān)系(例(χ/%))

2.2 肺癌組織中P-gp、GST-Ⅱ和TOPO-Ⅱ的共表達(dá)

在63例肺癌組織中，P-gp和TOPO-Ⅱ的單獨表達(dá)率分別為3.2%(2/63)和19.0%(12/63)，沒有發(fā)現(xiàn)GST-Ⅱ的單獨表達(dá)。P-gp和GST-Ⅱ的共表達(dá)率為49.2%(31/63)；GST-Ⅱ和TOPO-Ⅱ的共表達(dá)率為9.5%(6/63)；P-gp和TOPO-Ⅱ的共表達(dá)率為6.3%(4/63)；P-gp、GST-Ⅱ及TOPO-Ⅱ的共表達(dá)率為25.4%(16/63)。有兩個或兩個以上MDR基因產(chǎn)物共表達(dá)率合計為90.5%，明顯高于單獨基因產(chǎn)物P-gp和TOPO-Ⅱ的表達(dá)率(χ2=59.660,P<0.01)。

2.3 肺癌組織中的P-gp、GST-Ⅱ、TOPO-Ⅱ表達(dá)與Ki-67表達(dá)的相關(guān)性

Ki-67在肺癌組織中的陽性表達(dá)與P-gp、GST-Ⅱ的陽性表達(dá)之間無顯著相關(guān)性(P>0.05)，而與TOPO-Ⅱ的表達(dá)呈明顯正相關(guān)(r=0.380，P<0.01)。

3 討 論

MDR是導(dǎo)致肺癌化療失敗最難解決的問題之一[3]。MDR的產(chǎn)生是多基因、多途徑共同作用的結(jié)果，同時檢測多個MDR基因的表達(dá)，可為臨床提供更多的信息并指導(dǎo)臨床化療藥物的選擇。Ki-67作為一種核增殖抗原，是目前檢測腫瘤細(xì)胞增殖活性最可靠的指標(biāo)之一[4]。

P-gp是相對分子質(zhì)量為17萬的蛋白產(chǎn)物，生理功能相當(dāng)于一個藥物排除泵，將進(jìn)入癌細(xì)胞內(nèi)的抗癌藥物泵出癌細(xì)胞，從而使癌細(xì)胞內(nèi)藥物濃度降低，也可使藥物在細(xì)胞內(nèi)再分布，出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象[5-6]。因此，P-gp的表達(dá)水平與耐藥程度呈正相關(guān)。本文結(jié)果顯示，P-gp在非小細(xì)胞癌組織中陽性表達(dá)率明顯高于小細(xì)胞癌，腺癌高于磷癌(大細(xì)胞癌例數(shù)較少，未做統(tǒng)計)，此結(jié)果與臨床上小細(xì)胞癌化療最敏感、鱗癌次之、腺癌最差相符。說明P-gp的高表達(dá)是非小細(xì)胞肺癌產(chǎn)生耐藥性的主要原因。本文結(jié)果還顯示，P-gp的表達(dá)與病人年齡、性別、是否吸煙、腫瘤大小以及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)，與國外相關(guān)報道相符[7-8]。

GST-Ⅱ是一種藥物代謝酶，一方面可以催化親電物質(zhì)與谷胱甘肽結(jié)合，另一方面與親脂性細(xì)胞毒藥物結(jié)合增加藥物水溶性，促進(jìn)其代謝，從而降低抗癌藥物的細(xì)胞毒作用，GST-Ⅱ的陽性表達(dá)與腫瘤耐藥相關(guān)[9]。本文結(jié)果顯示，GST-Ⅱ的表達(dá)與肺癌病理學(xué)分型有關(guān)，GST-Ⅱ在非小細(xì)胞癌中的陽性表達(dá)率明顯高于小細(xì)胞癌，與臨床上小細(xì)胞肺癌首次化療敏感相符。由此可以認(rèn)為，GST-Ⅱ的高表達(dá)是非小細(xì)胞癌產(chǎn)生耐藥性的原因之一。中高分化癌與低分化癌相比，前者GST-Ⅱ的陽性表達(dá)率明顯高于后者，說明分化較高的肺癌耐藥性較強(qiáng)[10]。本文結(jié)果還顯示，GST-Ⅱ的表達(dá)與病人年齡、性別、是否吸煙、腫瘤大小以及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)。

TOPO-Ⅱ是DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄所需要的基本核酶，一方面作為細(xì)胞的增殖指數(shù)，另一方面作為抗癌藥物的靶點指數(shù)?；熕幬锶鏥P16、替尼泊苷和阿霉素等通過與TOPO-Ⅱ結(jié)合造成DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄異常，因此TOPO-Ⅱ是腫瘤治療的主要靶酶。本文的研究結(jié)果顯示，TOPO-Ⅱ在鱗癌和小細(xì)胞癌中的陽性表達(dá)率明顯高于腺癌，提示TOPO-Ⅱ的低水平表達(dá)使VP16等抑制劑喪失作用靶點，無法抑制TOPO-Ⅱ發(fā)揮作用，所以TOPO-Ⅱ可作為一種潛在的預(yù)示化療敏感性的標(biāo)記物[11]。本文結(jié)果還顯示，TOPO-Ⅱ的表達(dá)與病人年齡、性別、是否吸煙、腫瘤大小以及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)。

有文獻(xiàn)報道，Ki-67陽性表達(dá)率與肺癌的侵襲力、惡性程度呈正相關(guān)[12]。本文結(jié)果顯示，Ki-67的表達(dá)與肺癌組織類型及分化程度有關(guān)，在小細(xì)胞癌組織表達(dá)明顯高于非小細(xì)胞癌，在低分化癌組織表達(dá)明顯高于中高分化癌，說明癌組織分化程度越低，Ki-67表達(dá)越高，Ki-67表達(dá)與肺癌的惡性程度呈正相關(guān)。本文結(jié)果還顯示，Ki-67的表達(dá)與P-gp、GST-Ⅱ的表達(dá)之間無顯著相關(guān)性，與TOPO-Ⅱ的表達(dá)呈明顯正相關(guān)。說明TOPO-Ⅱ可作為一種研究腫瘤細(xì)胞增殖活性的特異性指標(biāo)[13]，同時檢測Ki-67和TOPO-Ⅱ可以更好地判斷瘤細(xì)胞的增殖狀態(tài)。

有研究表明，非小細(xì)胞肺癌存在多種耐藥基因共同表達(dá)的現(xiàn)象[14]。本文結(jié)果顯示，有兩個或兩個以上MDR基因產(chǎn)物的共表達(dá)率明顯高于單獨基因產(chǎn)物P-gp、GST-Ⅱ的表達(dá)率，提示肺癌耐藥的單基因作用較弱，其耐藥機(jī)制是多種基因共同作用的結(jié)果。P-gp、GST-Ⅱ、TOPO-Ⅱ三者可能相互依賴，共同作用，具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。因此，同時檢測P-gp、GST-Ⅱ、TOPO-Ⅱ可為臨床化療提供更多的耐藥信息，進(jìn)而指導(dǎo)臨床對化療藥物的選擇。

綜上所述，P-gp、GST-Ⅱ、TOPO-Ⅱ共同參與了肺癌的耐藥機(jī)制，三者相互依賴，共同作用；Ki-67與肺癌的惡性程度呈正相關(guān)。臨床上同時檢測上述4種基因，對于揭示肺癌耐藥的原因，估計化療效果，判斷預(yù)后，以及指導(dǎo)合理選擇化療藥物，制定有效的化療方案，延長肺癌病人的生存期意義很大。

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