李超柱, 陳艷華, 陳艷輝, 張艷秋, 方懷義

(1. 欽州學院, 廣西 欽州 535000; 2. 廣西醫(yī)科大學 附屬腫瘤醫(yī)院, 廣西 南寧 530021)

牡蠣(Oyster )俗稱大蠔、蠣黃、蠣子、海蠣等, 不僅是一種肉嫩、味鮮營養(yǎng)價值極高的海產食品, 也是一種很有藥用價值的海洋生物, 近些年來受到了國內外學者的重視。不少學者報道了牡蠣提取物具有抗腫瘤作用、抗氧化、對腫瘤細胞的放射增敏、清除氧自由基以及對動物機體的免疫調節(jié)作用等[1-7], 但對于牡蠣活性肽是否具有免疫調節(jié)作用, 尤其是免疫抑制作用仍鮮見報道。

蛋白質是一類最重要的大分子物質, 具有很重要的生理功能, 天然蛋白質不完全水解產生的長短不一的一些肽段稱為小分子多肽, 小分子多肽中具有生物活性的肽稱為活性肽。生物來源于海洋的活性物質由于特殊生長環(huán)境, 因而具有許多獨特的性質, 如結構特異、活性強、含量低微、毒副作用小等特點[8-9]。本研究利用動物蛋白水解酶水解牡蠣肉, 并對最佳水解產物進行柱層析和超濾分離獲得一種低分子質量(約為3 kD)活性肽, 并以小鼠脾淋巴細胞為實驗模型, 通過淋巴細胞增殖實驗和混合淋巴細胞實驗, 從細胞、分子水平研究牡蠣活性肽對小鼠脾淋巴細胞的免疫抑制活性及作用機制。

1 材料、試劑與儀器

1.1 材料、試劑

新鮮牡蠣, 采自廣西北部灣茅尾海海域, 去殼、清洗并勻漿, 置-20℃儲存?zhèn)溆? 動物蛋白酶購自廣西龐博生物有限公司(≥200 u/mg )。

SPF級BALB/c小鼠和昆明小鼠由廣西醫(yī)科大學實驗動物中心提供, 雄性, 體重22～24 g, 周齡6～8周。

RPMI 1640培養(yǎng)基(賽默飛世爾生物化學制品(北京)有限公司); 小牛血清(杭州四季青生物材料研究所); 磷酸鹽緩沖液(PBS); 淋巴細胞分離液; 絲裂霉素(惠州鴻雨科技有限公司); MTT(sigma公司); 伴刀豆蛋白A(ConA)(Sigma公司, 用雙蒸水配成2mg/mL的溶液, 過濾除菌)。

1.2 主要儀器

低速離心機(北京醫(yī)用離心機廠); 低溫孔板離心機(sigma公司); CO2培養(yǎng)箱(Thermo 公司), 酶聯(lián)免疫檢測儀( Thermo(上海)儀器有限公司); 倒置光學顯微鏡(Nikon中國有限公司); 超凈工作臺( 蘇州安泰空氣技術有限公司)。

2 方法

2.1 牡蠣蛋白活性肽的制備

原料蛋白—預處理—選擇最佳酶解條件水解—高溫滅酶—活性炭脫苦味去色—柱層析—超濾膜分離—冷凍干燥—組成與結構鑒定[10]。

將水解產物分子質量小于3 kD的活性肽配置成250、125、62.5、31.6、15.6、7.8 mg/L的濃度梯度。

2.2 小鼠淋巴細胞增殖實驗

小鼠脾淋巴細胞懸液的制備及原代培養(yǎng)方法, 頸椎脫臼處死BALB/c小鼠75%酒精消毒小鼠皮膚, 著重腹部消毒, 取出脾臟, 置有PBS緩沖液培養(yǎng)皿中撕脾, 經200目濾網過濾, 制備脾淋巴細胞懸液(冰上進行), 離心(2 000 r/min, 5 min), 棄上清液, 將脾細胞懸液體積按1 : 1的比例加入預裝有等量淋巴細胞分離液的離心管中, 離心30 min(2 000 r/min)。離心完畢吸取界面層單個核細胞(白細胞層), 再次用PBS緩沖液沖洗離心5 min(500 r/min), 棄上清液, 用含10%FCS的PRMI-1640培養(yǎng)基重懸細胞, 調整細胞濃度至1×106個/mL。

將細胞調好濃度后, 加入96孔板, 每孔100 μL, 用含10%胎牛血清的PRMI-1640培養(yǎng)基將ConA濃度配制為20 mg/L(終濃度為10 mg/L ), 加入干預活性肽的終濃度分別為250、125、62.5、31.6、15.6、7.8 mg/L, 每孔100 μL; 每組平行做3個復孔, 并設淋巴細胞+ConA空白對照3個復孔。

96孔板置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h, 加入5 g/LMTT, 每孔20 μL。4 h后低溫孔板離心機(3 000 r/min,4℃)離心, 10 min; 棄上清液, 加0.4 mol/L的鹽酸化異丙醇, 每孔100 μL; 待結晶物溶解后, 用酶標儀于492nm處測定吸光度。

2.3 混合淋巴細胞實驗

取BALB/c鼠脾淋巴細胞懸液稱為反應細胞(A)。取適量50 mg/L絲裂霉素加入昆明鼠脾淋巴細胞懸液內至終濃度25 mg/L, 37℃保溫30 min, PBS液洗兩遍, 用含小牛血清10%的RPMI-1640懸液細胞, 計數(shù), 配成一定濃度細胞, 稱為絲裂霉素處理的刺激細胞(B)。將上述制備好的兩種淋巴細胞按1 : 1的體積加入培養(yǎng)皿混合加96孔板, 對照組為100 μL 培養(yǎng)基+100 μL混合脾淋巴細胞, 加藥組為100 μL不同濃度的干預活性肽 + 100 μL混和脾淋巴細胞。在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育48 h, 于培養(yǎng)結束前4 h加入5 g/L MTT, 每孔20 μL, 培養(yǎng)結束顯微鏡下觀察其MTT結晶情況。然后用低溫孔板離心機(3000 r/min,4℃)離心, 10 min; 棄上清, 加0.4 mol/L的鹽酸化異丙醇, 每孔100 μL; 待結晶物溶解后, 用酶標儀于492 nm處測定吸光度。

2.4 ELISA 方法對體外培養(yǎng)的細胞進行細胞因子產生能力檢測

刀豆蛋白(ConA)激活的小鼠脾臟淋巴細胞, 經過活性肽作用后, 以 ELISA 方法檢測細胞培養(yǎng)上清液中細胞因子所分泌的細胞因子 IL-2和 IFN-γ的變化。首先, 原代培養(yǎng)小鼠脾淋巴細胞, 調節(jié)細胞懸液(2×106個/mL)。加入 24 孔培養(yǎng)板中, 1 mL/孔, 置 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng) 4 h, 加入 0.5 mL ConA(終濃度 5 mg/L)以及不同濃度的牡蠣活性肽, 牡蠣活性肽的濃度分別為低劑量 15.6 mg/L, 中劑量 62.5 mg/L, 高劑量 125 mg/L各 0.5 mL, 置37 , ℃5%CO2培養(yǎng) 48 h, 收集上清, -20℃保存待測。隨后進行 IL-2 和 IFN-γ 的ELISA 檢測。

2.5 統(tǒng)計分析方法

采用SPSS17.0 統(tǒng)計軟件包中多個樣本率比較的方法進行統(tǒng)計學分析, 計量數(shù)據用均數(shù)±標準差(x±s)表示, 以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果與討論

3.1 對小鼠脾淋巴細胞增殖和混合淋巴細胞生長的影響

從表1 可以看出, 牡蠣活性肽對小鼠脾淋巴細胞的生長抑制率出現(xiàn)明顯的量效關系, 即在一定濃度范圍內, 隨著濃度的升高, 抑制率增大。其IC50為125 mg/L。

表1 牡蠣活性肽對淋巴細胞的生長抑制率(n =3, x±s) Tab. 1 Inhibition of lymphocyte proliferation by oyster peptides (n = 3, x ± s)

免疫抑制劑通過抑制免疫細胞(T細胞和B細胞等巨噬細胞)的增殖和功能, 降低抗體免疫反應。在特異性抗原刺激下可以使相應的淋巴細胞克隆發(fā)生增殖。如刀豆蛋白ConA是T淋巴細胞有絲分裂原, 能在體外激活T細胞增殖, 并促進T細胞和單核細胞產生細胞因子[11]; 而脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)則刺激B細胞發(fā)生增殖。因此, 本研究采用混合淋巴細胞的增殖模型研究牡蠣蛋白活性肽的免疫活性。

3.2 對小鼠脾淋巴細胞因子IFN-γ和IL-2分泌的影響

采用雙夾心ELISA方法分別檢測小鼠脾淋巴細胞培養(yǎng)液上清中的細胞因子, 實驗結果表明, 牡蠣活性肽對ConA激活的小鼠脾臟淋巴細胞上清中分泌的細胞因子IL-2, IFN-γ有顯著的抑制作用, 呈現(xiàn)一定的劑量依賴性, 見圖2、圖3。

圖1 細胞因子IFN-γ和IL-2標準曲線 Fig. 1 The standard curves of cytokines IFN-γ and IL-2

圖2 ELISA檢測牡蠣活性肽作用后對細胞上清中IL-2的影響 Fig. 2 The detection of IL-2 in supernatant influenced by oyster bioactive peptides using ELISA method

圖3 ELISA檢測牡蠣活性肽作用后對細胞上清中IFN-γ的影響 Fig. 3 The detection of IFN-γ in supernatant influenced by oyster bioactive peptides using ELISA method

細胞因子(cytokine)是一類由抗原、有絲分裂原或其他刺激物活化的細胞分泌的、相對分子質量為 15～30 kD的糖蛋白。包括淋巴細胞因子、單核細胞因子及其他細胞產生的細胞因子[12]。這些因子在體內主要發(fā)揮抗感染、抗腫瘤作用、調節(jié)免疫、刺激造血細胞增殖分化以及參與和調節(jié)炎癥反應等生物學功能。白細胞介素-2(IL-2), 主要由活化的CD4+T細胞和CD8+T細胞產生, 是所有T細胞亞群的生長因子, 為調控免疫應答的重要因子, 免疫抑制劑可以抑制其活性和生成。已有大量文獻報道, 在器官移植后的排斥反應和自身免疫病如類風濕性關節(jié)炎、紅斑狼瘡、膜腎球腎炎、炎性腸病和免疫性溶血貧血等患者的血清或淋巴細胞培養(yǎng)上清液中, 炎癥性細胞因子IL-2的水平明顯升高[13]。IFN-γ可增強靶器官中抗原遞呈細胞或非抗原遞呈細胞異常表達組織相容性復合物分子, 促進對自身抗原的識別和提呈功能, 激活自身反應性T細胞, 從而誘發(fā)自身免疫性疾病。在自身免疫性肝炎、自身免疫性甲狀腺炎患者血清中IFN-γ明顯升高。本研究結果表明牡蠣蛋白活性肽可以抑制小鼠脾淋巴細胞分泌IL-2和TNF-γ, 由此推測牡蠣蛋白活性肽可能是通過抑制細胞因子的分泌來產生免疫抑制作用。

4 結論

近年來, 器官移植的手術正以每年5000余例次遞增, 是器官衰竭治療的最后有效手段, 術后的特殊用藥——免疫抑制劑, 對器官移植患者存活時間、移植器官功能維持等方面起著舉足輕重的作用。而目前臨床上使用的免疫抑制劑多為進口藥物, 價格昂貴, 此外臨床上常用的免疫抑制劑如糖皮素激素類、環(huán)磷酰胺、甲氨喋呤、硫唑嘌呤、環(huán)孢菌素、抗淋巴細胞血清、抗白介素-1及2受體抗體等, 毒副作用較大。因此尋找開發(fā)高效、低毒的免疫抑制劑, 是當今器官移植藥物研究的熱點。

本研究發(fā)現(xiàn)在一定濃度范圍內牡蠣蛋白活性肽能抑制小鼠脾淋巴細胞和混合淋巴細胞的增殖, 具有明顯的免疫抑制活性。研究結果顯示牡蠣活性肽有希望作為一種新的免疫抑制劑進行開發(fā)應用研究, 在動物皮瓣移植模型上進一步探討其體內抗排斥功效。

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