楊小青, 盧虹玉, 李延平, 劉 義

(1. 廣東醫(yī)學(xué)院 廣東天然藥物研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣東 湛江 524023; 2. 廣東海洋大學(xué) 水產(chǎn)品加工廣東普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣東 湛江 524045)

羊棲菜(Sargassum fusiforme)是一種褐藻門馬尾科植物, 多分布在我國沿海, 已有大規(guī)模人工養(yǎng)殖[1], 有較高的食用和藥用價(jià)值, 是重要的經(jīng)濟(jì)海藻[2]。近年來, 隨著海藻資源開發(fā)利用研究的不斷發(fā)展, 羊棲菜因富含多糖、多酚、萜類等多種生物活性成分而引起了人們的關(guān)注。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明, 羊棲菜及其提取物具有抗氧化、抗腫瘤、降血脂、降血糖等多種功效[3]。

研究發(fā)現(xiàn)羊棲菜含有較高的褐藻多酚(phlorotannin), 可占藻體干質(zhì)量的2%, 僅次于海黍子[4]。褐藻多酚是主要存在于褐藻類植物中的一類獨(dú)特的次生化合物, 其基本結(jié)構(gòu)單元是間苯三酚[5]。研究表明, 羊棲菜褐藻多酚具有卓越的抗氧化和自由基清除能力[6-7]。由于越來越多的證據(jù)表明, 自由基參與許多疾病的病理過程, 從而誘發(fā)如心血管疾病、癌癥、神經(jīng)退行性等疾病[8]。因此,尋找天然來源的自由基清除劑和抗氧化劑對(duì)于該類疾病的防治具有重要意義。目前有關(guān)羊棲菜多酚的活性報(bào)道多限于粗提物, 未見進(jìn)一步的研究[9-11]。本文對(duì)羊棲菜褐藻多酚(SFP)的粗提物進(jìn)行了精制純化, 并檢測(cè)不同分子質(zhì)量SFP餾分的體外自由基清除活性, 旨在尋找自由基清除效果好的SFP組分, 為羊棲菜的開發(fā)利用提供更詳實(shí)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器和材料

1.1.1 儀器

SHZ-D()Ⅲ循環(huán)水式真空泵(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司); EYELAN-1000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(TOKYO RIKAKIKAI CO.LTD JAPAN); DLSB-5/25低溫冷卻循環(huán)泵(河南斯泰儀器有限公司); SKY-1102C恒溫培養(yǎng)搖床(上海蘇坤); 電子天平BS210S(北京塞多利斯儀器系統(tǒng)有限公司); himacCRⅡ高速離心機(jī)(HITACHI); EYELA FDU-1100冷凍干燥儀(TOKYO RIKAKIKAI CO.LTD JAPAN); UV2550紫外分光光度(SHIMADZU)。

1.1.2 材料

羊棲菜購于浙江溫州三豐水產(chǎn)食品有限公司; DPPH(1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼)購于日本東京株式會(huì)社; VE、沒食子酸(GA)、Vc均購于美國Sigma公司; 羥自由基與超氧陰離子試劑盒購于南京建成生物工程研究所, 其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 不同分子質(zhì)量羊棲菜褐藻多酚的制備

將所購羊棲菜陰干后用打粉機(jī)打磨成粉, 稱取干粉480 g用80%甲醇按1 : 10室溫浸提3次, 每次12 h, 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除甲醇, 經(jīng)正己烷、乙酸乙酯萃取后獲得水相和乙酸乙酯相SFP提取物, 兩相分別過截留分子質(zhì)量為30 000、10 000及5 000的超濾膜包, 獲得水相分子質(zhì)量大于30 000(SFPW1)、10 000～ 30 000(SFPW2)、50 00～10 000(SFPW3)、小于 5 000(SFPW4)以及乙酸乙酯相分子質(zhì)量大于 30 000(SFPO1)、10 000～30 000(SFPO2)、5 000～ 10 000(SFPO3)、小于5 000(SFPO4)共8個(gè)組分, 經(jīng)冷凍干燥后留待備用。

1.2.2 多酚含量的測(cè)定

采用Folin－Ciocalteu法[12]測(cè)定各組分多酚含量。取10 mL棕色容量瓶, 加入1 mL樣品, 2 mL Folin-Ciocalteu試劑搖勻, 2 min后加入12 mol/L的Na2CO3溶液6 mL, 混合充分后于暗處靜置60 min, 于765 nm處測(cè)定吸光度。以GA為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線, 各組分多酚含量以其在羊棲菜總酚中所占質(zhì)量百分?jǐn)?shù)表示。

1.2.3 總抗氧化能力的測(cè)定

采用普魯士藍(lán)法[13]檢測(cè)各組分的總抗氧化能力。取10 mL容量瓶, 加入樣品1 mL, 去離子水 5 mL, 1 mol/L鹽酸0.2 mL, 1%鐵氰酸鉀1.5 mL, 1%十二烷基硫酸鈉(SDS)0.5 mL, 0.2%六水合三氯化鐵0.5 mL, 定容至10 mL, 室溫放置30 min后于750 nm處測(cè)定吸光度值。以GA為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線, 在同一濃度下(3 mg/L)比較Vc、VE及SFP在750 nm處吸光度。

1.2.4 DPPH清除率的測(cè)定

稱取10 mg DPPH置于100 mL棕色容量瓶中, 用無水乙醇定容至100 mL, 配制成濃度為100 mg/L DPPH標(biāo)準(zhǔn)溶液。將GA、Vc、VE及SFP分別配制成不同的濃度梯度。取2 mL DPPH標(biāo)準(zhǔn)溶液, 加入2 mL 配制好的樣品混勻反應(yīng)60 min后, 以50% 乙醇為空白對(duì)照, 于527nm 處測(cè)吸光度值為A, 另取2 mL DPPH標(biāo)準(zhǔn)溶液加入2 mL去離子水按上法測(cè)吸光度值為A0, 清除率= (A0-A)/A0×100%。

1.2.5 羥自由基清除率的測(cè)定

將GA、Vc、VE及SFP分別配制成不同的濃度梯度, 以蒸餾水代替樣品作空白按試劑盒說明進(jìn)行操作, 測(cè)得吸光度值為A0, 測(cè)得樣品吸光度值為A, 清除率=(A0-A)/A0×100%。

1.2.6 抗超氧陰離子自由基的測(cè)定

將GA、Vc、VE及SFP配制成40 mg/L的樣品, 按試劑盒說明測(cè)得吸光度值為A, 蒸餾水代替樣品測(cè)得吸光度值為A0, 清除率=(A0-A)/A0×100%。

2 結(jié)果

2.1 不同分子質(zhì)量SFP含量

不同分子質(zhì)量SFP含量結(jié)果如表1。各組分含量以其在羊棲菜提取物總酚中所占質(zhì)量百分?jǐn)?shù)表示。水相各組分多酚含量明顯比乙酸乙酯相高, SFPW1含量最高, 兩相中各組分多酚含量隨著分子質(zhì)量的降低而逐漸降低。

表1 不同分子質(zhì)量SFP的含量 Tab. 1 Content of SFP with different molecular weight

2.2 不同分子質(zhì)量SFP總抗氧化能力

在同一濃度3 mg/L下比較各組分的總抗氧化能力, 結(jié)果見圖1。乙酸乙酯相各組分的總抗氧化能力均強(qiáng)于水相, 其中SFPO4總抗氧化能力最強(qiáng), 相當(dāng)于2.36 mg/L的GA, 強(qiáng)于VE及Vc; 除SFPW2外其余組分總抗氧化能力均介于Vc與GA之間。這樣的結(jié)果表明羊棲菜可作為天然抗氧化劑的來源。

2.3 不同分子質(zhì)量SFP對(duì)DPPH的清除率

不同分子質(zhì)量SFP對(duì)DPPH的清除率及IC50值見表2。由表2可知各組分對(duì)DPPH的清除率均能達(dá)到平臺(tái)期, 但與陽性對(duì)照比各組分對(duì)DPPH沒有突出的清除能力。在20 mg/L濃度下比較各組分清除率發(fā)現(xiàn)SFPO1對(duì)DPPH清除能力最強(qiáng), 清除率達(dá)到77.2%; SFPW3最弱, 清除率僅為50.2%。比較各組分清除50% DPPH所需濃度可知, SFPO1最低, 為10.1 mg/L, 優(yōu)于VE; 其他組分均高于陽性對(duì)照, 其中SFPO4最高, 達(dá)到21.4 mg/L。

2.4 不同分子質(zhì)量SFP對(duì)羥自由基的清除能力

不同分子質(zhì)量SFP對(duì)羥自由基的清除率及IC50值見表3。由表3可見, 不同分子質(zhì)量SFP對(duì)羥自由基的清除能力均好于陽性對(duì)照; 在20 mg/L濃度下, SFPO1與SFPO2對(duì)羥自由基清除能力相當(dāng), 清除率分別為77.6%和77.1%, SFPW2清除能力最弱, 清除率只有25.4%。由表3可知, 乙酸乙酯相對(duì)羥自由基的清除能力明顯強(qiáng)于水相; SFPO1對(duì)羥自由基的清除能力最好, IC50為9.04 mg/L。

圖1 3 mg/L濃度下不同分子質(zhì)量SFP總抗氧化能力 Fig. 1 Total antioxidant capacity of SFP with different molecular weight at the concentration of 3 mg/L

表2 不同分子質(zhì)量SFP對(duì)DPPH的清除率及IC50值 Tab. 2 Scavenging effect and IC50 values of SFP with different molecular weight on DPPH

表3 不同分子質(zhì)量SFP對(duì)羥自由基的清除率及IC50值 Tab. 3 Scavenging effect and IC50 values of SFP with different molecular weight on hydroxyl free radical

2.5 不同分子質(zhì)量SFP抗超氧陰離子自由基的能力

在40 mg/L濃度下比較各組分對(duì)超氧陰離子自由基清除率結(jié)果見圖2。乙酸乙酯相SFP對(duì)超陰離子的清除能力明顯強(qiáng)于水相, 水相各組分對(duì)超氧陰離子清除能力無差別。SFPO1對(duì)超氧陰離子的清除能力最強(qiáng), 強(qiáng)于陽性對(duì)照, 清除率達(dá)到18.6%; 其余組分均高于GA和Vc。

圖2 40 mg/L濃度下不同分子質(zhì)量SFP對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力 Fig.2 Scavenging ability of SFP with different molecular weight on super anion radical at the concentration of 40 mg/L

3 分析與討論

DPPH·是一類較為穩(wěn)定的自由基, 屬于芳香類自由基, 其較長的半衰期使該方法保持了良好的重現(xiàn)性, 應(yīng)用DPPH進(jìn)行定量分析簡(jiǎn)便、快速且不受葡萄糖等雜質(zhì)的干擾[14]。因此, DPPH法是一種評(píng)價(jià)天然抗氧化劑氧化活性快速、簡(jiǎn)便、靈敏可行的方法, 在國內(nèi)外應(yīng)用廣泛[15-16]。O2-·不僅自身具有毒性, 而且可以經(jīng)過一系列反應(yīng)生成其他活性氧自由基, 進(jìn)一步對(duì)生物體產(chǎn)生損傷作用, 且停留時(shí)間較長。超氧陰離子自由基是生物活性最高的氧中心自由基之一, 它在生命過程和化學(xué)反應(yīng)中作為電子受體, 形成不同的活性氧自由基鏈中的第一個(gè)自由基, 經(jīng)過一系列反應(yīng)生成其他的氧自由基[17]。在各種活性氧自由基中, 羥自由基的反應(yīng)活性最強(qiáng)(二階速率: 10-1010/M/S), 對(duì)機(jī)體危害最大, 因?yàn)椤H是僅次于F- 的強(qiáng)氧化劑, 幾乎可以和所有的細(xì)胞組分(核酸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等)發(fā)生反應(yīng)[18]?？梢娺@兩種自由基具有較大的危害, 清除O2-·和·OH具有重要的意義。

實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)羊棲菜褐藻多酚主要以高分子質(zhì)量形式存在, 而這與褐藻多酚結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)有關(guān)。魏玉西等[5]在報(bào)道中提到, 褐藻多酚中間苯三酚連接方式及單體數(shù)量的不同, 導(dǎo)致了褐藻多酚化合物的結(jié)構(gòu)差異, 酚羥基的還原性是酚類化合物的共性之一,故Folin－Ciocalteu法中磷鉬酸和磷鎢酸被還原的程度不同而顏色不同, 所得樣品含量亦有差異, 而這都與樣品的結(jié)構(gòu)密切相關(guān), 高分子質(zhì)量褐藻多酚以間苯三酚單體多聚形成, 能作為氫供體的酚羥基比低分子質(zhì)量褐藻多酚多, 測(cè)得的高分子質(zhì)量褐藻多酚含量高。

對(duì)所得SFP 8個(gè)組分總抗氧化能力及對(duì)DPPH、羥自由基、超氧陰離子自由基清除能力的檢測(cè)研究后發(fā)現(xiàn), SFPO1的綜合抗氧化活性最好, 甚至對(duì)羥自由基與超氧陰離子的清除能力強(qiáng)于沒食子酸、VE和Vc。林超等[19]通過對(duì)BEL-7402人肝癌細(xì)胞株和A-549人肺癌細(xì)胞株的抑制活性篩選實(shí)驗(yàn),證明鼠尾藻中高相對(duì)分子質(zhì)量的海藻多酚抗腫瘤作用強(qiáng)于低相對(duì)分子質(zhì)量海藻多酚。他們還發(fā)現(xiàn)鼠尾藻和海黍子中高分子質(zhì)量多酚的抑菌作用好于低分子質(zhì)量多酚。魏玉西等[20]研究了鼠尾藻和海黍子兩種褐藻中高相對(duì)分子質(zhì)量褐藻多酚的抗氧化活性, 結(jié)果表明, 其對(duì)羥自由基,超氧陰離子和DPPH均有很高的清除效率。Blunden 等[21]從泡葉藻和墨角藻分離出具有裂解質(zhì)粒DNA、抑制某些酶等生物活性的高相對(duì)分子質(zhì)量褐藻多酚。可見高分子質(zhì)量的褐藻多酚在多種活性上比低分子質(zhì)量褐藻多酚更具優(yōu)勢(shì), 這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)不同分子質(zhì)量段SFP抗氧化活性的研究, 證實(shí)羊棲菜褐藻多酚會(huì)因?yàn)榉肿淤|(zhì)量大小和溶劑的不同而表現(xiàn)出不同的抗氧化活性。在已得到羊棲菜褐藻多酚組分中乙酸乙酯萃取相分子大于 30 000的綜合抗氧化活性最好, 對(duì)于部分自由基的清除能力甚至強(qiáng)于沒食子酸、VE和Vc。為下一步的分離SFP得到高純度、高活性的天然抗氧化劑提供了依據(jù)。

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