高啟禹 李宏彬 陳紅麗 孔雨 周晨妍

（1.河南新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院 河南省遺傳性疾病與分子靶向藥物重點實驗室培育基地，新鄉(xiāng) 453003；2.河南新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，新鄉(xiāng) 453003；3.河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新鄉(xiāng) 453003）

堿性磷酸單酯酶（Alkaline phosphatase，AKP，EC3.1.3.1）是一種能催化各種磷酸單酯水解釋放出無機(jī)磷的酶，通常以前體的形式廣泛存在于原核及真核生物的外周胞質(zhì)中，最終在膜通道中形成成熟的堿性磷酸單酯酶［1］。該酶是一種非特異性的水解酶，能水解賴氨酸、精氨酸等堿性氨基酸組成的肽鍵、酰胺鍵及酯鍵等［2］。作為一種膜結(jié)合蛋白，一般可從小牛、豬和雞等動物的腸粘膜上提?。?］，但由于從動物體所獲得的目的蛋白在穩(wěn)定性、材料來源及分離純化上存在嚴(yán)重的缺陷，因此影響著AKP在DNA體外重組及化妝品等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。同時作為分離獲得的游離酶，在保質(zhì)期、重復(fù)利用率、應(yīng)用成本及穩(wěn)定性上往往無法滿足生產(chǎn)需要。因此選用一定的固定化材料對游離酶進(jìn)行固定，可有效改善酶的應(yīng)用范圍及應(yīng)用價值。目前納米材料已成為酶固定化新型載體研究的熱點，已在酶的固定化研究中得到了廣泛的探討［4，5］。殼聚糖修飾的乳酸－羥基乙醇酸共聚物（PLGA）作為納米材料，能夠體現(xiàn)納米載體良好的生物相容性、較大的比表面積、較小的顆粒直徑、較小的擴(kuò)散限制、有效提高載酶量及在溶液中能穩(wěn)定存在等優(yōu)點［6］。

本研究在重組大腸桿菌堿性磷酸單酯酶基因的克隆、表達(dá)及純化的基礎(chǔ)上，通過合成的殼聚糖-PLGA納米材料為載體，對堿性磷酸單酯酶進(jìn)行了固定，同時采用戊二醛為交聯(lián)劑，優(yōu)化AKP的固定化條件，探討固定化酶與游離酶的酶學(xué)特性，旨在為該酶的進(jìn)一步應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

PLGA（M=10 000-30 000，乳酸與羥基乙醇酸的摩爾比為50∶50，山東省醫(yī)療器械研究所），殼聚糖（低分子量，脫乙酰度85%，Sigma公司），重組大腸桿菌phoA（由華東理工大學(xué)分子生物學(xué)實驗室提供），Sephadex G-75、DEAE-纖維素（北京鼎國生物技術(shù)有限公司），谷胱苷肽（氧化型、還原型）、尿素、瓊脂糖、戊二醛等試劑采購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 CS-PLGA納米粒的制備 采用超聲乳化法制備納米粒，見參考文獻(xiàn)［7，8］。

1.2.2 堿性磷酸單酯酶的分離與純化 將含有外源基因的重組菌培養(yǎng)后收集培養(yǎng)液，4 000 r/min，常溫離心20 min后收集菌體并超聲破碎，將破碎液在4℃、12 000 r/min下離心20 min，棄上清液，在沉淀中加入6 mL去離子水，攪拌后于4℃、12 000 r/min下離心20 min，重復(fù)洗滌后保留沉淀。在沉淀中加入1 mL溶解液（8 mol/L尿素），攪拌并于4℃冰箱放置溶解2 h。其后在4℃、12 000 r/min下再離心20 min，得上清液。在冰浴條件下緩慢加入復(fù)性液（0.01 mol/L pH8.0 Tris-HCl緩沖液+1 mmol/L氧化型谷胱苷肽+1 mmol/L還原型谷胱苷肽的混合液+1 mmol/L MgCl2+0.16 mol/L尿素），同時用玻棒輕輕攪勻后置于冰箱復(fù)性48 h，測活。

將粗酶液采用DEAE-纖維素凝膠及Sephadex G-75凝膠層析后洗脫、濃縮、透析，獲得純化的堿性磷酸單酯酶液。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立見參考文獻(xiàn)［9］。在405 nm處測吸光值，得標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性回歸方程為：y=1.242 9x-0.054 3，R2=0.991 8。結(jié)果表明對硝基苯酚在此濃度范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系，可以用于酶活力的測定。

圖1 對硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.2.4 堿性磷酸單酯酶酶活測定 以對硝基酚磷酸二鈉為底物，根據(jù)水解磷酯鍵所產(chǎn)生的對硝基酚量測定酶活力。在37℃、pH10.0條件下，每分鐘轉(zhuǎn)化產(chǎn)生1 μmol/L對硝基酚的酶量為1個酶單位。具體為：分別在試管中加入250 μL、0.02 mol/L對硝基酚磷酸二鈉及750 μL Na2CO3-NaHCO3（pH10.0，0.1 mol/L）的底物緩沖液，混勻，在水浴37℃預(yù)熱5 min，加入250 μL酶液（空白對照管用緩沖液替代），立即混勻后，37℃保溫反應(yīng)20 min。立即加入0.5 mL 0.5 mol/L NaOH溶液終止反應(yīng)，于分光光度計中測定A405值。固定化酶活力測定時用一定量的固定化酶替換原酶液并用緩沖液定容，測定相應(yīng)吸光值并確定相對酶活力。

相對酶活力：以同組試驗中酶活最高點的值記為100，相對酶活為其他試驗點酶活值與該值之比。

固定化酶活力回收率（%）=固定化酶活力/投入的游離酶活力×100%

1.2.5 堿性磷酸單酯酶的固定化 取50 mg CS-PLGA納米粒，加入1 mL Tris-HCl緩沖液（0.05 mol/L，pH7.6）充分?jǐn)嚢韬蟪?5 min。再加入10 mL分離純化的酶溶液，在4℃攪拌吸附2 h后用4%的戊二醛溶液交聯(lián)1.5 h。再于4℃下固定10 h，離心棄去上清液，再用緩沖液洗去固定化酶表面游離酶后得固定化酶，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 正交試驗數(shù)據(jù)處理方法 依據(jù)單因素試驗結(jié)論，進(jìn)行正交試驗設(shè)計，優(yōu)化堿性磷酸單酯酶的固定化條件。

2 結(jié)果

2.1 納米材料的電鏡掃描分析

納米粒的掃描電鏡顯示（圖1），未被殼聚糖修飾的PLGA納米粒球狀形態(tài)較規(guī)則（圖1-A），相互間結(jié)合度較小，而被修飾的納米材料結(jié)合較緊密（圖1-B），說明PLGA納米粒表面被殼聚糖進(jìn)行了有效修飾。

圖1 納米粒子的電鏡掃描

2.2 突變酶的表達(dá)及純化

SDS-PAGE分析（圖2）表明，重組大腸桿菌中堿性磷酸單酯酶得到了高效表達(dá)，同時經(jīng)凝膠層析后獲得了純度較高的酶液，其分子量介于43-66.2 kD之間，與AKP的理論分子量約50 kD相符合。

圖2 SDS-PAGE分析凝膠層析產(chǎn)物

2.3 單因素試驗結(jié)果

設(shè)定固定化方法中其他影響因子不變，以選擇的影響因素為研究對象，探討在單因素條件下固定化酶的相對酶活力。

2.3.1 CS-PLGA納米粒的質(zhì)量分?jǐn)?shù)對固化酶活力的影響 由圖3可知，CS-PLGA納米顆粒的質(zhì)量分?jǐn)?shù)對固定化酶的活力有一定的影響，當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)濃度高于50 mg時，固定化酶的相對活力有所下降，可能較高濃度的載體在擴(kuò)散限制、有效載酶量等方面影響酶促反應(yīng)的進(jìn)行。

圖3 CS-PLGA納米粒質(zhì)量濃度對固定化酶活力的影響

2.3.2 戊二醛體積分?jǐn)?shù)對固化酶活力的影響 采用雙功能試劑戊二醛進(jìn)行交聯(lián)固定對酶的固定化效果具有重要影響。圖4表明，在戊二醛濃度較低時，酶的結(jié)合量少，因而固定化酶活性較低。但當(dāng)戊二醛濃度過高時，過多的戊二醛與酶結(jié)合，使酶的空間剛性增加，柔性降低，從而影響酶與底物的結(jié)合，其適宜的戊二醛濃度約為4%。

圖4 戊二醛體積分?jǐn)?shù)對固定化酶活力的影響

2.3.3 交聯(lián)時間對固定化酶活力的影響 由圖5可知，固定化堿性磷酸單酯酶的活力在交聯(lián)時間1.5 h時最高。主要是由于低于1.5 h時，戊二醛和酶蛋白的結(jié)合不完全，而高于1.5 h時，過多的醛基對酶分子本身進(jìn)行了相應(yīng)的修飾，致使固定化酶活力降低。

圖5 交聯(lián)時間對固定化酶活力的影響

2.3.4 固定化時間對固定化酶活力的影響 由圖6可以看出，固定化酶的活力受固定化時間的影響。在固定化時間為10 h 時，固定化酶的活力達(dá)到最大值。同時由于酶與載體的結(jié)合需要相應(yīng)的時間，因此固定化初期其酶活較低，但在達(dá)到最大值后，延長固定化時間會導(dǎo)致酶交聯(lián)程度過高，形成的載體結(jié)構(gòu)對酶的結(jié)合能力降低，從而影響到酶促反應(yīng)的速率。

圖6 固定化時間對固定化酶活力的影響

2.3 CS-PLGA納米材料固定木聚糖酶的條件優(yōu)化

表1 因素水平表

由表1和表2可知，對于固定化堿性磷酸單酯酶的活力，根據(jù)極差分析R值可以看出，影響固定化酶酶活的因素主次順序依次為A、C、B、D，根據(jù)其K值判斷組成的最優(yōu)組合為A2C3B2D1，即最佳固定化條件為納米顆粒質(zhì)量分?jǐn)?shù)50 mg、戊二醛體積分?jǐn)?shù)4%、交聯(lián)時間2.0 h、固定化時間9.0 h。經(jīng)驗證試驗，在極差分析得到的最佳條件下，測得固定化酶的酶活回收率為76.2%。

表2 正交試驗結(jié)果分析

2.4 固定化和游離酶最適pH值及pH穩(wěn)定性

酶分子在水溶液環(huán)境中的解離狀態(tài)和酶與底物的親和力都受到pH的影響。經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)差（SD）分析及圖7顯示，AKP被固化后其最適反應(yīng)pH值有所變化，pH分別由9.5變化為10.0，且保持了較高的活性。同時對熱穩(wěn)定性的研究（圖8）發(fā)現(xiàn)，在堿性條件下，固定化酶更穩(wěn)定。

圖7 pH對游離酶及固定化酶酶活力的影響

圖8 游離酶及固定化酶的pH穩(wěn)定性

2.5 固定化木聚糖酶的最適溫度和熱穩(wěn)定性

圖9 溫度對游離酶及固定化酶的影響

圖10 游離酶及固定化酶的溫度穩(wěn)定性

溫度對酶活性有顯著影響，在一定的溫度范圍，由于產(chǎn)生了更多的活化分子而使酶的活性升高，但溫度過高會引起蛋白變性，導(dǎo)致酶活性逐漸喪失。圖9顯示，游離酶與固定化酶的最適溫度未發(fā)生明顯變化，均為45℃，但經(jīng)SD分析發(fā)現(xiàn)，固定化酶的適應(yīng)溫度范圍較自由酶更加廣泛。同時對固定化酶的熱穩(wěn)定性研究（圖10）發(fā)現(xiàn)，在45℃水浴保溫90 min后，固定化酶的活性保持在60%左右，而游離酶的活力約為40%，說明酶被固定化后其熱穩(wěn)定性有所增強(qiáng)。

3 討論

自酶固定化技術(shù)誕生近百年以來，各種固定化載體材料獲得了大量研究，特別是隨著納米技術(shù)的發(fā)展，納米材料作為固定化酶的新型載體，在酶的固定化應(yīng)用上體現(xiàn)了極高的表面積/體積比，致使固定化的物質(zhì)集中化，從而提高了酶的固載量，獲得了較優(yōu)良的固定化酶。但是在對不同酶進(jìn)行納米材料固定化的應(yīng)用研究中發(fā)現(xiàn)，單一地采用未經(jīng)修飾的納米材料的固定化效果往往會因為材料本身的自我團(tuán)聚而導(dǎo)致酶活性的嚴(yán)重下降［10］。因而采用某些試驗技術(shù)，在合成的納米載體表面引入不同的化學(xué)基團(tuán)（如-CHO、-NH、-OH、-COOH、-SH等），或連接上具有特殊功能的大分子物質(zhì)（如糖類、酯類等），從而構(gòu)建具有復(fù)合功能的納米材料。研究表明，復(fù)合材料的固定化效果更加明顯，能在保持較高酶活的同時，拓寬了酶的穩(wěn)定性，改善了酶的操作半衰期等［11］，從而為提高酶的工業(yè)化應(yīng)用奠定了較好的應(yīng)用前景。

4 結(jié)論

通過對PLGA納米材料載體進(jìn)行殼聚糖的修飾，獲得了復(fù)合材料CS-PLGA，同時采用戊二醛為交聯(lián)劑，對在重組大腸桿菌中表達(dá)的堿性磷酸單酯酶進(jìn)行了分離純化和固定，探討了酶的最佳固定化條件。通過單因素分析、正交設(shè)計研究發(fā)現(xiàn)，在納米顆粒質(zhì)量分?jǐn)?shù)50 mg、戊二醛體積分?jǐn)?shù)4%、交聯(lián)時間2.0 h、固定化時間9.0 h條件下，固定化酶的活力最高。同時對游離酶及固定化酶的最適pH、最適溫度及pH穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性進(jìn)行了相應(yīng)的探討，研究發(fā)現(xiàn)，AKP采用納米載體CS-PLGA固定后，拓寬了其最適反應(yīng)條件及其穩(wěn)定性。

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