梁俊婷 李鹿之 陳少鵬 焦湞

（1.鄭州大學(xué) 離子束生物工程省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450052；2.中國(guó)科學(xué)院合肥物質(zhì)科學(xué)研究院技術(shù)生物與農(nóng)業(yè)工程研究所，合肥 230031）

自1962年Shimomura等［1］首次從維多利亞多管水母（Aequoria victoria）中分離出綠色熒光蛋白（avGFP）后，到目前為止，通過(guò)一系列體外分子進(jìn)化的手段發(fā)展出幾乎覆蓋整個(gè)熒光光譜的GFP突變體，如藍(lán)色（Blue）、青色（Cyan）、黃色（Yellow）熒光蛋白［2-5］。綠色熒光蛋白主要作為報(bào)告基因應(yīng)用于生命科學(xué)領(lǐng)域。然而，1997年Abedi等［6］將20個(gè)氨基酸殘基的短肽插入到GFP松散的Loop位點(diǎn)處，其中大部分插入的位點(diǎn)都嚴(yán)重影響熒光蛋白的折疊和發(fā)光，但同時(shí)篩選出了少數(shù)合適的插入位點(diǎn)，在插入外源短肽后仍能正常發(fā)射熒光。這種體外進(jìn)化GFP的方式不同于以往改造GFP的方式，傳統(tǒng)的方法主要采用一輪或多輪的點(diǎn)突變改造GFP熒光蛋白。隨后，Baird等［7］對(duì)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）的每一個(gè)位點(diǎn)做了更為系統(tǒng)和精確的篩選，其可插入外源短肽的位點(diǎn)基本上與GFP保持一致，但是其他的熒光蛋白或者GFP突變體是否也具有類似的或不同的耐受外源短肽插入的位點(diǎn)呢？

1999年，紅色熒光蛋白drFP583［8］（商品名是DsRed，558 nm/583 nm）首次被發(fā)現(xiàn)，極大豐富了熒光蛋白的光譜多樣性。較之GFP及其突變體，紅色熒光蛋白drFP583的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)大大增加，而且具有在組織成像方面背景熒光低等諸多優(yōu)勢(shì)。因此，紅色熒光蛋白引起了研究人員的廣泛關(guān)注。但是野生型的drFP583體內(nèi)外均易形成四聚體且成熟速度慢［9］，這些缺陷極大限制了它在生物學(xué)上的應(yīng)用。為了克服這些缺點(diǎn)，研究人員隨后通過(guò)多輪的隨機(jī)突變和定點(diǎn)突變改造，在2002年首次得到了紅色熒光蛋白drFP583的單體mRFP1［10］。與野生型drFP583相比，mRFP1具有更長(zhǎng)的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)（584 nm/607 nm），其熒光亮度更強(qiáng)，成熟速度更快。在mRFP1的基礎(chǔ)上，Shaner等［11］通過(guò)多輪隨機(jī)和定點(diǎn)突變得到了mCherry。優(yōu)化后的mCherry比mRFP1熒光亮度更亮，成熟時(shí)間更短，激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)更長(zhǎng)（587 nm/610 nm）。因其諸多優(yōu)良性能，mCherry備受研究人員的青睞。

已有研究表明mCherry類似GFP，可以插入外源短肽［12］。為了獲得更多的更合適的插入位點(diǎn)，本研究使用mCherry為靶熒光蛋白，旨在通過(guò)轉(zhuǎn)座子的突變系統(tǒng)尋找mCherry中可供外源短肽插入的位點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒和培養(yǎng)基 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Trans I及質(zhì)粒pUC19均購(gòu)自北京全式金生物公司。LB培養(yǎng)基、SOC培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基配方參考分子克隆實(shí)驗(yàn)指南（第3版）。LB/Agar/Amp培養(yǎng)基（Amp終濃度是200 μg/mL），LB/Agar/Amp/Kan培養(yǎng)基（Amp終濃度是200 μg/mL，Kan終濃度為10 μg/mL）。

1.1.2 主要的試劑 Not I 、EcoR I 和Sal I限制性酶以及DNA Ladder Marker購(gòu)買于TaKaRa公司。高保真酶KOD Plus 購(gòu)自ToYoBo公司。普通Taq酶購(gòu)自北京TIANGEN生物公司。IPTG（異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷）貯存濃度為100 mmol/L，工作濃度為1 mmol/L。T4連接酶購(gòu)自NEB公司。PCR產(chǎn)物純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒均為Axygen公司產(chǎn)品。寡核苷酸引物合成和DNA測(cè)序由上海生工生物公司完成。轉(zhuǎn)座子隨機(jī)突變?cè)噭┖蠱utation Generation SystemTMKit（F-701）購(gòu)自Finnzymes公司。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒構(gòu)建 用于擴(kuò)增mCherry的上下游引物分 別 為：F：5'-TCAGACGAATTCGGTACCGGCGGC TCCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGG-3'，R：5'-AG ATTGTCGACGGTACCGCCCTTGTACAGCTCGTCCATG CCGC-3'。分別在上游引物加上限制酶EcoR I，下游引物加上限制酶Sal I，mCherry經(jīng)PCR擴(kuò)增后，經(jīng)EcoR I 和Sal I 酶切?；厥誱Cherry酶切片段連接到經(jīng)EcoR I 和Sal I 酶切的質(zhì)粒pUC19上，得到重組質(zhì)粒pUC-MC。轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Trans I中，使用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒pUC-MC。

1.2.2 以轉(zhuǎn)座子試劑盒為基礎(chǔ)的突變體系統(tǒng) 按照轉(zhuǎn)座子隨機(jī)突變?cè)噭┖蠱utation Generation SystemTMKit說(shuō)明書，使用具有Kan抗性的MuA轉(zhuǎn)座子進(jìn)行體外轉(zhuǎn)座反應(yīng)。將自身DNA隨機(jī)轉(zhuǎn)座到已經(jīng)構(gòu)建好的質(zhì)粒pUC-MC（靶DNA）上。體外轉(zhuǎn)座反應(yīng)體系按照說(shuō)明書要求，在1.5 mL的離心管中分別加入1 μL轉(zhuǎn)座子，120 ng目的DNA（質(zhì)粒pUC-MC），4 μL Buffer，1 μL MuA轉(zhuǎn)座酶，最后加入超純水至終體積20 μL。輕輕混勻后30℃反應(yīng)1 h，75℃水浴10 min，滅活MuA轉(zhuǎn)座酶。

1.2.3 mCherry 及其突變體的獲得 取2 μL轉(zhuǎn)座酶體外轉(zhuǎn)座反應(yīng)系統(tǒng)的反應(yīng)混合物，加入到50 μL Trans I感受態(tài)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化后涂布在LB/Agar/Amp培養(yǎng)板上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。收集所有的細(xì)菌克隆后提取質(zhì)粒。EcoR I 和Sal I 酶切后，瓊脂糖凝膠電泳，產(chǎn)生4條明亮且大小不同的條帶（圖1-A）。這4條帶大小分別為3.8 kb（2.7 kb質(zhì)粒+1.1 kb轉(zhuǎn)座子），2.7 kb（空質(zhì)粒），1.8 kb（0.7 kb mCherry +轉(zhuǎn)座子）和0.7 kb（mCherry）?；厥?.8 kb和2.7 kb的條帶，連接后轉(zhuǎn)化，涂板，37℃培養(yǎng)過(guò)夜后，收取所有克隆，最終得到在mCherry中插入轉(zhuǎn)座子的細(xì)菌庫(kù)，提質(zhì)粒，得到pUC-MC/TS。由于轉(zhuǎn)座子序列兩端均含有特定的Not I酶切位點(diǎn)，質(zhì)粒pUC-MC/TS 經(jīng)Not I酶切后，轉(zhuǎn)座子基因基本被切除，僅留下包括Not I酶切位點(diǎn)在內(nèi)的15 個(gè)堿基，得到質(zhì)粒pUC-MC/15 bp。

1.2.4 mCherry及其突變體的誘導(dǎo)表達(dá) 將構(gòu)建好的質(zhì)粒系統(tǒng)pUC-MC/TS和pUC-MC/15 bp分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Trans I，在含有200 μg/mL Amp或（和）10 μg/mL Kan的TB培養(yǎng)液中，37℃，180 r/min條件下培養(yǎng)12 h。然后將菌液1∶50接種在含有相應(yīng)抗生素的TB培養(yǎng)液中，在37℃，180 r/min下培養(yǎng)菌液直到OD600達(dá)到0.4。加入IPTG誘導(dǎo)使其終濃度為1 mmol/L，在16℃，180 r/min條件下誘導(dǎo)mCherry熒光蛋白，8 h后流式細(xì)胞儀檢測(cè)其熒光變化。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)及分選 將誘導(dǎo)后表達(dá)mCherry的菌液12 000 r/min離心去上清，用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗2遍。調(diào)整菌液OD600值為0.2后，用AriaIII流式細(xì)胞儀（BD）進(jìn)行分選和檢測(cè)（激發(fā)波長(zhǎng)：561 nm，發(fā)射波長(zhǎng)：610 nm）。3次平行試驗(yàn)后，根據(jù)其相對(duì)熒光強(qiáng)度，觀察突變體相對(duì)于野生型mCherry的熒光變化。

1.2.6 mCherry突變體測(cè)序 在流式細(xì)胞儀分選陽(yáng)性菌液培養(yǎng)后挑取單克隆菌斑，測(cè)序。各測(cè)序結(jié)果與mCherry序列比對(duì)后確認(rèn)有15個(gè)堿基插入到mCherry序列即可認(rèn)定為陽(yáng)性克隆。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)來(lái)自至少3次重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果的表示方法為：x-±s。數(shù)據(jù)組之間的顯著性分析用 students’t test方法，P<0.05為顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 mCherry短肽插入突變體庫(kù)的構(gòu)建

利用轉(zhuǎn)座子隨機(jī)突變系統(tǒng)將轉(zhuǎn)座子（Kan抗性）隨機(jī)插入到質(zhì)粒pUC-MC，使用mCherry兩端特定的限制酶EcoR I和Sal I 酶切后得到4條不同大小的DNA片段（圖1-A），將含有轉(zhuǎn)座子序列的mCherry片段（1.8 kb）連接到pUC19片段（2.7 kb）上得到突變體庫(kù)pUC-MC/TS（圖1-B）。在此突變體庫(kù)的基礎(chǔ)上，使用限制酶Not I切除突變體pUC-MC/TS上的轉(zhuǎn)座子序列，在原位置殘留15個(gè)堿基。這樣便得到15個(gè)堿基僅插入到mCherry序列的質(zhì)粒突變體庫(kù)pUC-MC/15 bp（圖1-C）。

圖1 突變體庫(kù)pUC-MC/TS和pUC-MC/15 bp的構(gòu)建

2.2 mCherry短肽突變體的篩選

適當(dāng)?shù)臈l件下誘導(dǎo)表達(dá)mCherry短肽突變體后，使用流式細(xì)胞分選儀（ArialIII，BD）分選出陽(yáng)性細(xì)菌（圖2），表達(dá)紅色熒光蛋白的大腸桿菌如圖2-B P3所示。擴(kuò)大培養(yǎng)后，即獲得插入短肽后仍發(fā)熒光的突變體群。

2.3 mCherry短肽突變體的獲得

將流式細(xì)胞儀分選出的陽(yáng)性菌培養(yǎng)后涂板，挑取單克隆后測(cè)序。測(cè)序的各突變體序列與原始mCherry序列比對(duì)后，確定15個(gè)堿基插入到mCherry序列及其插入位置，然后分析其在熒光蛋白mCherry二級(jí)結(jié)構(gòu)中的插入位置。

測(cè)序結(jié)果顯示，有15個(gè)堿基插入到mCherry序列的克隆共有53個(gè)，占所有測(cè)序的單克隆總數(shù)（85個(gè)）的64%，即篩選mCherry短肽突變體的陽(yáng)性率約64%。同時(shí)，共有13個(gè)mCherry短肽突變體誘導(dǎo)后仍發(fā)射紅色熒光，其插入位置分別位于mCherry氨基酸序列的第K9、E10、F11、F65、G90、G116、K121、E148、M150、L157、G171、V187和T223氨基酸殘基位置處，分別簡(jiǎn)稱為m9、m10、m11、m65、m90、m116、m121、m148、m150、m157、m171、m187和m223（圖3）。

圖2 流式細(xì)胞儀篩選誘導(dǎo)后表達(dá)質(zhì)粒突變體pUC-MC/15bp的大腸桿菌

圖3 5個(gè)外源氨基酸所在mCherry二級(jí)結(jié)構(gòu)中相應(yīng)氨基酸殘基的位置（方框所示）

2.4 mCherry短肽突變體熒光亮度的測(cè)定

將上述13個(gè)mCherry短肽突變體及野生型mCherry在相同誘導(dǎo)條件下誘導(dǎo)后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)它們?cè)诖竽c桿菌內(nèi)的表達(dá)。mCherry短肽突變體的熒光亮度與野生型mCherry（未插入的熒光強(qiáng)度為100%）相比明顯減弱（圖4）。

3 討論

圖4 質(zhì)粒突變體pUC-MC/15bp中15個(gè)堿基插入mCherry序列的氨基酸位數(shù)對(duì)應(yīng)mCherry突變體的相對(duì)熒光強(qiáng)度

Mu噬菌體是目前研究DNA轉(zhuǎn)座的理想模型之一，其轉(zhuǎn)座機(jī)理［13］已有詳盡報(bào)道。本研究采用MuA轉(zhuǎn)座酶催化的轉(zhuǎn)座子突變系統(tǒng)，將轉(zhuǎn)座子隨機(jī)插入到熒光蛋白mCherry中，經(jīng)轉(zhuǎn)座子兩端特定的Not I 限制酶切后，剩余15個(gè)堿基殘留在mCherry序列中。但是，15個(gè)堿基插入到mCherry序列后，熒光蛋白mCherry的熒光大部分都已經(jīng)消失，只有在若干個(gè)特定位點(diǎn)處mCherry仍保留較強(qiáng)熒光。這些特定的位點(diǎn)主要分布在N/C末端，第3、4個(gè)β折疊之間，第5、6個(gè)β折疊之間，第8、9個(gè)β折疊之間，第9、10個(gè)β折疊之間以及第6、7、8個(gè)β折疊上。Li等［12］證明了mCherry可耐受外源短肽插入的位點(diǎn)主要分布在第1、2個(gè)β折疊之間，第6、7個(gè)β折疊之間，第9、10個(gè)β折疊之間，但認(rèn)為最耐受插入外源肽段的位點(diǎn)是在第9、10個(gè)β折疊之間的Loop結(jié)構(gòu)。本研究顯示，雖然在第9、10個(gè)β折疊之間的Loop結(jié)構(gòu)（第187位氨基酸殘基）處的突變體m187仍能發(fā)出56%的相對(duì)熒光，但并無(wú)充分的證據(jù)證實(shí)此Loop結(jié)構(gòu)最耐受外源肽段的插入。第9、10個(gè)β折疊之間的Loop中第V187位氨基酸殘基處插入的m187突變體的熒光強(qiáng)度與插入其他Loop結(jié)構(gòu)處的突變體短肽相比熒光最亮；第5、6個(gè)β折疊之間的熒光蛋白突變體亮度最低，約為野生型mCherry熒光亮度的15%。因此本研究證明此Loop結(jié)構(gòu)中耐受外源短肽插入的程度較弱。

另外，本研究在β折疊上也篩選出4個(gè)不同的插入位點(diǎn)，與插入到松散的Loop結(jié)構(gòu)中的各個(gè)位點(diǎn)相比，熒光蛋白突變體的亮度總體降低。但在第7個(gè)β折疊上有兩個(gè)位點(diǎn)處（第E148和M150位）的熒光蛋白突變體均能發(fā)出較亮的熒光。這說(shuō)明與其他β折疊相比，這兩個(gè)位點(diǎn)處或其附近的位點(diǎn)耐受度較強(qiáng)。迄今為止，仍未有相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道，系統(tǒng)篩選出熒光蛋白mCherry的β折疊上所有耐受外源短肽插入的位點(diǎn)。本研究使用突變轉(zhuǎn)座系統(tǒng)，首次將β折疊柱上可插入位點(diǎn)系統(tǒng)的篩選出來(lái)，共有4個(gè)可插入位點(diǎn)。同時(shí)本研究還發(fā)現(xiàn)，位于熒光蛋白mCherry的發(fā)色體（MYG）附近的第F65位突變體m65，熒光強(qiáng)度約為原來(lái)的52%。

本研究證明的可插入位點(diǎn)不僅包括已有相關(guān)報(bào)道的附近位點(diǎn)，如V187處與Li等［12］報(bào)道的K184位都在第9、10個(gè)β折疊柱之間的Loop結(jié)構(gòu)，而且證實(shí)了更多不同的位點(diǎn)，這極大地增加了熒光蛋白mCherry中可插入的位點(diǎn)的數(shù)目，為試驗(yàn)的進(jìn)一步設(shè)計(jì)（如熒光雙分子互補(bǔ)技術(shù)）提供更多可選擇的位點(diǎn)。同時(shí)，也為改造熒光蛋白作為生物感受器或者插入更長(zhǎng)外源短肽提供了更多可參考的位點(diǎn)。

4 結(jié)論

采用轉(zhuǎn)座子隨機(jī)突變系統(tǒng)最終將5個(gè)氨基酸短肽隨機(jī)到熒光蛋白mCherry中，共篩選出13個(gè)特定插入位點(diǎn)。這些插入外源短肽的mCherry突變體仍然能發(fā)出較強(qiáng)的熒光，其中第9、10個(gè)β折疊柱間的Loop結(jié)構(gòu)耐受外源短肽插入的能力較強(qiáng)；相反，在第5、6個(gè)β折疊柱間耐受度較弱。

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