趙燕 陳庚華 周衛(wèi) 侯亞利 楊忠華

（武漢科技大學(xué)化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院，武漢 430081）

纖維素是一種長(zhǎng)鏈糖類(lèi)，主要由結(jié)晶和非結(jié)晶兩種形式構(gòu)成，是自然界中較為豐富的可再生生物資源，若對(duì)其合理廣泛應(yīng)用，可在一定程度上減輕全球普遍存在的能源危機(jī)問(wèn)題。因此，自1906年纖維素酶從蝸牛消化液中被發(fā)掘出來(lái)之后，全球開(kāi)始了對(duì)纖維素酶的廣泛研究。雖然自然界中很多生物可以產(chǎn)生纖維素酶，但是面對(duì)能源壓力和市場(chǎng)化的需求，如何進(jìn)一步提高纖維素酶的產(chǎn)量和生產(chǎn)水平，是迫在眉睫的問(wèn)題。而對(duì)纖維素酶基因的研究為此開(kāi)辟了一條新的可行途徑。

1 纖維素酶與生物能源

由于目前全球性的能源壓力，使很多科研機(jī)構(gòu)和企業(yè)嘗試尋找新的可再生能源來(lái)代替現(xiàn)有的石化資源。專家普遍認(rèn)為，緩解能源壓力除了目前新興的以微藻為原料制備第二代生物柴油之外［1］，還可采用酶水解碳水化合物形成糖類(lèi)，并進(jìn)一步發(fā)酵生成乙醇。甘蔗中含有大量的蔗糖等糖分，其逐漸成為生產(chǎn)生物乙醇的主要原料。而甘蔗制備蔗糖后剩下的甘蔗渣可用于燃燒，提供蒸汽帶動(dòng)機(jī)器運(yùn)作。但是這種做法并不能使蔗渣得到充分的利用，且燃燒蔗渣等秸稈廢物產(chǎn)生的CO2等氣體，是溫室效應(yīng)的主要原因。鑒于環(huán)境問(wèn)題和對(duì)燃料乙醇產(chǎn)量的需求，在對(duì)甘蔗的利用方面，其除產(chǎn)生蔗糖之外，逐漸轉(zhuǎn)變成酶解提取蔗糖后的廢棄蔗渣（大部分為纖維素），從而得到更多的糖分制備乙醇等能源［2］。纖維素酶水解纖維素制備生物能源，不僅能解決工業(yè)生產(chǎn)廢棄纖維素堆積造成的空間污染問(wèn)題，而且可將廢棄纖維素更合理充分的利用于生產(chǎn)生活以及農(nóng)畜業(yè)。

因此，纖維素作為全球普遍大量存在的可再生多糖資源，應(yīng)用前景非常廣闊。纖維素生物質(zhì)可以通過(guò)水解發(fā)酵分離（SHF）法，采用單一的水解酶將其水解為糖類(lèi)物質(zhì)，隨后用另一種酶發(fā)酵為液體燃料；也可以通過(guò)厭氧菌的水解-發(fā)酵耦合方式轉(zhuǎn)化為燃料乙醇［3］。近年來(lái)對(duì)于纖維素酶的研究應(yīng)用主要采用物理或者化學(xué)的方法調(diào)控植物體內(nèi)纖維素、半纖維素以及木質(zhì)素的形成，從而改變纖維素的纖維組成［4］。纖維素酶水解利用生活、森林和農(nóng)業(yè)廢棄纖維素制備生物燃料，具有廣闊的前景，故受到全球關(guān)注。大部分的生產(chǎn)工藝為生產(chǎn)乙醇的工藝流程，而Wilson等［5］曾用纖維素酶和纖維素制備可摻雜在汽油里的丁醇，供汽車(chē)使用，不但汽油和丁醇的溶合性很好，而且汽車(chē)行駛路程也略有增加。

湯斌［6］，李旭東［7］等研究了纖維素酶在稀酸的作用下對(duì)秸稈產(chǎn)燃料乙醇的預(yù)處理，分別以0.8%（W/W）或質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4 %的稀硫酸處理，得到了最佳效果。江丹等［8］研究發(fā)現(xiàn)，利用纖維素酶可處理造紙污泥發(fā)酵產(chǎn)生乙醇，發(fā)酵條件優(yōu)化后乙醇的發(fā)酵率最高可達(dá)到95.97%，具有一定的工業(yè)應(yīng)用前景。

2 纖維素酶商業(yè)化趨勢(shì)

作為水解纖維素制備生物能源的“工具”，市場(chǎng)上對(duì)纖維素酶的質(zhì)量和需求量日益增高。而由于纖維素酶的用途廣泛，其除了制備生物能源之外，還可以制備成飼料添加劑、織物洗滌劑、造紙工業(yè)等有關(guān)的酶制劑投入工業(yè)生產(chǎn)。Genencor和Novozyme兩家公司是目前生產(chǎn)生物催化轉(zhuǎn)化型纖維素酶較具代表性的公司。Genencor公司近幾年研發(fā)了酶Accelerase?1500，該酶由基因工程改造的里氏木霉分泌，同最初研發(fā)的Accelerase?1000相比，在制備生物乙醇方面經(jīng)濟(jì)效益更高，故而被專門(mén)用于木質(zhì)纖維素的生物燃料制備工藝［9］。

Novozyme公司生產(chǎn)和制備的纖維素酶較多元化，如用在紡織業(yè)的Cellusoft?AP和Cellusoft?CR，衣物清潔劑中所含的Carezyme?和Celluclean?，低溫清洗石料中用到的Denimax?等針對(duì)性的酶制劑。2009年，Novozyme公司聲明其生產(chǎn)的纖維素酶制劑在生物質(zhì)水解方面具有可應(yīng)用性。雖然產(chǎn)品的相關(guān)信息和市場(chǎng)實(shí)用性尚不清楚，但對(duì)于纖維素酶的發(fā)展有著一定的意義。表1［9］中列舉的是目前世界上生產(chǎn)出售纖維素酶的主要公司以及制備酶的菌種，其中大部分菌種都是經(jīng)過(guò)改造的基因工程菌。

3 纖維素酶工程

纖維素酶在能源方面的優(yōu)勢(shì)及其商業(yè)化趨勢(shì)使其在生活和生產(chǎn)中的需求量逐漸增加。雖然自然界中很多絲狀真菌可以生產(chǎn)分泌纖維素酶，但是其產(chǎn)酶水平、酶量和酶的性能并不能滿足市場(chǎng)化商業(yè)化的需求。?hgren等［10］曾試圖將纖維素酶糖基化與發(fā)酵工藝相偶聯(lián)，但仍不能體現(xiàn)纖維素的最佳應(yīng)用效果。影響纖維素應(yīng)用的主要問(wèn)題是天然纖維素酶在對(duì)纖維素水解的實(shí)際應(yīng)用中沒(méi)有可行性或者可行性很低［11］。近10年來(lái)，對(duì)纖維素酶的研究逐漸轉(zhuǎn)移到基因方面。過(guò)去的研究結(jié)果顯示，纖維素酶水解纖維素主要是3個(gè)組分的協(xié)同作用，各個(gè)酶組分之間互相創(chuàng)造合適的結(jié)合位點(diǎn)，并解決產(chǎn)物對(duì)酶的抑制作用［12，13］，目前國(guó)內(nèi)外都試圖采用基因調(diào)控的手段提高產(chǎn)業(yè)化纖維素酶各組分的產(chǎn)量和酶學(xué)性質(zhì)。

3.1 纖維素酶結(jié)構(gòu)域功能

3.1.1 真菌纖維素酶結(jié)構(gòu)研究 很多絲狀真菌可以分泌纖維素酶，但目前研究較為深入的是T.reesei纖維素酶體系，已鑒定出其分泌的8種主要纖維素酶，并通過(guò)克隆技術(shù)成功制備2種葡萄糖苷酶［14］。

1988年，Stahlberg等［15］通過(guò)試驗(yàn)證明，絲狀真菌T. reesei產(chǎn)纖維素酶具有很大的開(kāi)發(fā)潛力，并猜想纖維素酶催化區(qū)含有纖維素結(jié)合域（CBD），其功能主要是可以自主的結(jié)合和脫離結(jié)晶纖維素。隨后科研試驗(yàn)對(duì)纖維素酶的研究更多著重于T.reesei及其基因方向。Saloheimo等［16］于1988年發(fā)現(xiàn)，自然界中T. reesei內(nèi)切葡聚糖酶（EG）III的C-末端與纖維素結(jié)合域（CBD）之間存在一個(gè)由21個(gè)氨基酸組成的信號(hào)序列。因此推斷，內(nèi)切葡聚糖酶纖維素結(jié)合域（CBDEDIII）編碼區(qū)的第一個(gè)密碼子不是起始密碼子AUG，而編碼區(qū)的最后一個(gè)密碼子也并不是終止密碼子UAG。該發(fā)現(xiàn)對(duì)隨后CBDEDIII基因重組以及在宿主中的表達(dá)研究有著重要意義。

隨著對(duì)纖維素酶基因的研究，1996年，Linder和Teeri［17］證實(shí)，大多數(shù)T. reesei都可以產(chǎn)生非催化性質(zhì)的CBD，而T. reesei的EG III基因重組后對(duì)纖維素的親和性是完全可逆的。而Kleman-leyer［18］和GAO等［19］曾先后發(fā)現(xiàn)重組纖維素酶對(duì)纖維素纖維的解聚去纖能力同天然纖維素酶相比有顯著的提高。2001年山東大學(xué)試驗(yàn)得出，CBDEDIII對(duì)結(jié)晶纖維素的作用主要是破壞多糖鏈間和鏈內(nèi)的氫鍵［20］。

表1 商業(yè)化纖維素酶生產(chǎn)公司及其產(chǎn)酶菌種［9］

3.1.2 細(xì)菌纖維素酶結(jié)構(gòu) 大多數(shù)細(xì)菌的纖維素酶為內(nèi)切葡聚糖酶，有些細(xì)菌含有一些特殊的編碼基因，如葡萄糖苷酶基因，以及與纖維磷酸化相關(guān)的酶基因［21］。侯?lèi)?ài)華等［22］2002年對(duì)細(xì)菌纖維素酶研究認(rèn)為，一些細(xì)菌產(chǎn)生分泌的纖維素酶常聚合形成纖酶小體結(jié)構(gòu)的多酶復(fù)合體。細(xì)菌生產(chǎn)分泌纖維素酶雖然量少，大多無(wú)法作用于結(jié)晶纖維素且不是胞外酶，但很多產(chǎn)纖維素酶細(xì)菌的CBD區(qū)含有的氨基酸大多不帶電荷，羥基氨基酸為主要成分，肽鏈末端半胱氨基酸的位置基本相同［23］。細(xì)菌中的纖維素酶小體成簇?zé)o規(guī)律的分散于細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)，目前研究較多的是C. thermocellum，其大多數(shù)的纖維素酶小體都聚集在cel簇上。2005年時(shí)，cip C-cel 48F等12個(gè)基因已完全被鑒定出來(lái)，并且證實(shí)轉(zhuǎn)錄從cip C起始［24］。Demain［25］研究發(fā)現(xiàn)，C. thermocellum的纖維素酶基因中存在纖維素酶小體和非纖維素酶小體兩種基因。

3.2 纖維素酶基因的研究

早在20世紀(jì)80年代，DNA重組技術(shù)已用來(lái)克隆和鑒定微生物體內(nèi)的纖維素酶基因，研究最多的為編碼Eng和Exg的胞外纖維素酶基因［26］。香港科技大學(xué)自1988年開(kāi)始研究纖維素酶產(chǎn)生菌，目前克隆過(guò)Cellulomonas fimi中編碼Eng和Exg的基因：cenA和cex，并成功將其導(dǎo)入多種宿主中［26］。由于Cellulomonas biazotea分泌Cel能力較高，并且與C. fimi具有一定的相關(guān)性［27］，該實(shí)驗(yàn)室目前主要研究Cellulomonas biazotea中Cel同Eng和Exg的協(xié)同作用。

Kim等［28］將耐熱菌Aquifex aeolicus VF5中編碼耐熱內(nèi)切葡聚糖酶的基因（Cel8Y）克隆轉(zhuǎn)導(dǎo)入E. coli XL1-Blue中。通過(guò)表達(dá)和檢測(cè)，該內(nèi)切葡聚糖酶在80℃時(shí)有最大酶活，在100 ℃時(shí)酶活可持續(xù)2 h。

Hakamada等［29］純化并研究了Bacilluis circulans高等電點(diǎn)堿性葡聚糖內(nèi)切酶，采用盒式連接對(duì)其基因進(jìn)行PCR，得到的結(jié)構(gòu)基因含有一個(gè)單一的開(kāi)放閱讀框，編碼407個(gè)氨基酸，其中包括一條大約有30個(gè)氨基酸的信號(hào)肽。

蔡勇等［30］利用大腸桿菌作為宿主細(xì)胞，從芽孢桿菌CY1-3中克隆表達(dá)出具有纖維素酶活性的CelC蛋白。2009年，Rahman等［31］在研究纖維素酶與木糖酶的同源重組性時(shí)，提出理想情況下，可以用T. reesei的cbh1啟動(dòng)子和終止子構(gòu)建表達(dá)載體來(lái)制備同源和異源性蛋白質(zhì)。而通過(guò)熒光蛋白標(biāo)記，對(duì)cbh1啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性測(cè)定可達(dá)到細(xì)胞水平［32］。

Kitagawa等［33］將Clostridium thermocellum的內(nèi)切葡聚糖酶基因（Ctcel8A）與質(zhì)粒相連后轉(zhuǎn)入酵母二倍體細(xì)胞，得到的缺失菌株與野生型菌株相比，內(nèi)切葡聚糖酶的活力有所提高。在對(duì)缺失菌株分類(lèi)后，經(jīng)試驗(yàn)證實(shí)vps3Δ和vps16Δ菌株異源性表達(dá)產(chǎn)生的β-葡糖苷酶活性很高。

華東理工大學(xué)［34］2011年構(gòu)建了隨機(jī)整合型pWEF 31和定點(diǎn)整合型pWEF 32基因表達(dá)載體。這兩種基因可以通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)入里氏木霉，構(gòu)建載體后通過(guò)紅色標(biāo)記基因［35］檢測(cè)可確定構(gòu)建的載體的實(shí)用性。通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)pWEF 31比較適合用于隨機(jī)性的重組試驗(yàn)，而pWEF 32則適用于同源性重組。該研究對(duì)絲狀真菌基因功能和表達(dá)的研究極其有利。

Anthony等［36］2012年報(bào)道了一種從Cellulomonas biazotea克隆得到的新型纖維二糖酶基因（cba3），該基因編碼的β-葡萄糖苷酶屬于糖苷水解酶家族1（GH 1），而以往研究和報(bào)道C. biazotea的cba3基因編碼得到β-葡萄糖苷酶都是糖苷水解酶家族3的成員，這是首次在C. biazotea中得到GH 1家族的β-葡萄糖苷酶。

到目前為止，以大腸桿菌或者酵母細(xì)胞為宿主菌，很多細(xì)菌或者真菌的纖維素酶基因得到了表達(dá)。李旺等［37］總結(jié)，在纖維素酶基因研究和克隆的早期，若想獲得纖維素酶基因較完整的信息，可通過(guò)構(gòu)建DNA文庫(kù)和cDNA文庫(kù)的方法。而隨著技術(shù)的進(jìn)步，目前可采用人工合成和選擇性的從宏基因組中擴(kuò)增等方式獲得纖維素酶基因。

這些研究及其成果，使人工構(gòu)建的重組纖維素酶投入廣泛工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用成為可能。本實(shí)驗(yàn)室目前著手研究綠色木霉中內(nèi)切葡聚糖酶基因在大腸桿菌中的克隆表達(dá)，若成功構(gòu)建工程菌，對(duì)纖維素酶的工業(yè)利用有著深遠(yuǎn)意義。

4 結(jié)語(yǔ)

纖維素除了用于制備生物能源，還可以作為添加劑投入工業(yè)生產(chǎn)，如生產(chǎn)可降解塑料等。由于纖維素制備燃料乙醇仍有許多限制，其制備尚不能達(dá)到大量工業(yè)化的水平［38］。鑒于纖維素酶的實(shí)用性和市場(chǎng)前景，國(guó)內(nèi)外對(duì)纖維素酶的基因研究和改造取得了很大進(jìn)展。纖酶小體的發(fā)現(xiàn)，使細(xì)菌纖維素酶的研究有了很大的進(jìn)展。然而工程菌的制備對(duì)表達(dá)體系要求較高，加大了纖維素酶工程菌制備的難度。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，對(duì)纖維素酶工程菌研究的逐漸完善以及各級(jí)加工工藝的發(fā)展，將大大推動(dòng)纖維素酶的市場(chǎng)化應(yīng)用。

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