劉麗麗 王健 吳巍 王海勝 閆艷春

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100081）

1981年美國(guó)俄勒岡大學(xué)著名遺傳學(xué)家George Streisinger在《Nature》雜志上發(fā)表關(guān)于斑馬魚(yú)人工雌核發(fā)育的研究論文，標(biāo)志著斑馬魚(yú)開(kāi)始進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室模式生物研究領(lǐng)域，至今已有超過(guò)30年的歷史。20世紀(jì)90年代中國(guó)開(kāi)始參與斑馬魚(yú)研究。近幾年，隨著斑馬魚(yú)模式生物南方中心、北方中心和國(guó)家種質(zhì)資源庫(kù)相繼成立，中國(guó)斑馬魚(yú)研究也開(kāi)始進(jìn)入高速發(fā)展階段。由于體積小、代時(shí)短、胚胎透明、體外發(fā)育等特點(diǎn)，斑馬魚(yú)在模式生物研究中的地位越來(lái)越重要。隨著顯微注射、重組體構(gòu)建以及熒光標(biāo)記等技術(shù)的快速發(fā)展，轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)已經(jīng)廣泛用于脊椎動(dòng)物基因表達(dá)調(diào)控、發(fā)育分化、形態(tài)發(fā)生、人類(lèi)疾病、藥物篩選和環(huán)境檢測(cè)等研究領(lǐng)域。本文將就斑馬魚(yú)在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究中的應(yīng)用進(jìn)行介紹，并對(duì)該領(lǐng)域存在的問(wèn)題進(jìn)行總結(jié)。

1 常見(jiàn)模式生物

1.1 模式生物的發(fā)展歷史

模式生物（model organism）能夠代表一類(lèi)生物的基本特點(diǎn)，結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單并易于進(jìn)行試驗(yàn)操作，因此普遍用于遺傳學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、生理學(xué)和分子細(xì)胞學(xué)等方面的研究。其普遍特點(diǎn)是：首先，生理特征能夠代表生物界的某一大類(lèi)群；其次，試驗(yàn)材料容易獲得，并易于在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)飼養(yǎng)、繁殖速度快，研究維持費(fèi)用低；最后，容易進(jìn)行試驗(yàn)操作，特別是遺傳學(xué)分析［1］。一般認(rèn)為模式生物的應(yīng)用源于格里高·約翰·孟德?tīng)枺℅regor Johann Mendel）以豌豆為材料對(duì)遺傳學(xué)的研究。1866年孟德?tīng)栐l(fā)表文章說(shuō)他的試驗(yàn)是“解決問(wèn)題的唯一方法”。此后對(duì)模式生物的選擇遵循兩個(gè)方面的原則：一是該物種在系統(tǒng)進(jìn)化中的地位符合研究目的，二是該物種特性適于特定研究的試驗(yàn)需要［2］。在漫長(zhǎng)的科學(xué)研究歷史中，各領(lǐng)域發(fā)展了多種模式生物，如大腸桿菌、釀酒酵母、秀麗隱桿線蟲(chóng)、海膽、果蠅、擬南芥及小鼠等。模式生物的應(yīng)用大大促進(jìn)了基礎(chǔ)生命科學(xué)和實(shí)驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展。為闡明模式生物的遺傳背景，促進(jìn)基因組研究，人類(lèi)基因組計(jì)劃（HGP）最先提出模式生物基因組計(jì)劃，并初步確定了6種模式生物：大腸桿菌、酵母、線蟲(chóng)、果蠅、擬南芥和小鼠。

1.2 模式生物的各自特點(diǎn)及應(yīng)用領(lǐng)域

自從萊德伯格（Joshua Lederberg）應(yīng)用大腸桿菌（Escherichia coli，E. coli）進(jìn)行遺傳學(xué)研究以來(lái)［3］，大腸桿菌迅速成為廣泛應(yīng)用的原核模式生物。它具有遺傳背景清楚、操作技術(shù)簡(jiǎn)便、成本低、易于大規(guī)模培養(yǎng)等特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)，而且還特別適合作為外源基因表達(dá)的宿主。因此，大腸桿菌是目前應(yīng)用最廣泛、最成功的克隆原核基因的表達(dá)體系。釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）作為最簡(jiǎn)單的低等單細(xì)胞真核生物之一，是研究細(xì)胞周期、胚胎形態(tài)發(fā)生、染色體穩(wěn)定性和衰老的優(yōu)秀模型，哈特維爾（Leeland H. Hartwell）和納斯（P. M. Nurse）以釀酒酵母為材料，為揭示細(xì)胞周期的調(diào)控機(jī)理作出了重要貢獻(xiàn)。前者提出了細(xì)胞周期關(guān)卡（cell-cycle checkpoint）的概念，并確定了大量的控制細(xì)胞周期的基因（cdc），后者從粟酒酵母（S. pombe）中分離到第一個(gè)基因cdc2，并提出來(lái)相關(guān)的調(diào)控體系［4］。秀麗隱桿線蟲(chóng)（Caenorhabditis elegans）結(jié)構(gòu)非常簡(jiǎn)單，一條雌雄同體的秀麗隱桿線蟲(chóng)只有不超過(guò)1 000個(gè)細(xì)胞，遵循特定的分裂模式。同時(shí)，它還具有多細(xì)胞生物的基本特征，如復(fù)雜的器官系統(tǒng)（complex organ system）、社會(huì)行為、性行為和學(xué)習(xí)行為等，為傳染性疾?。?］和多種人類(lèi)疾?。?］的研究提供模型。許多生物進(jìn)化的保守機(jī)制都是通過(guò)秀麗隱桿線蟲(chóng)闡明的，包括程序性細(xì)胞死亡（programmed cell death）［7］、胰島素信號(hào)［8］、衰老［9］和神經(jīng)生物學(xué)（neurobiology）［10］，也使自然免疫和RNA干擾（RNAi）機(jī)制的研究取得了巨大進(jìn)展［11］。20世紀(jì)70-80年代，基于對(duì)果蠅（Drosophila melanogaster）的研究工作，興起了胚胎學(xué)和分子生物學(xué)，從此果蠅成為遺傳學(xué)研究最重要的材料之一。試驗(yàn)中分離鑒定到大量的果蠅突變體，促進(jìn)了動(dòng)物發(fā)育學(xué)和疾病的研究。擬南芥（Arabidopsis thaliana）是植物界最重要的模式生物，在研究器官發(fā)育、植物干細(xì)胞生 物 學(xué)［12］、圖 式 形 成（pattern formation）［13］、先天免疫（innate immunity）［14］、晝夜節(jié)律（circadian rhythm）［15］、各種性征的自然突變［16］以及諸多發(fā)育機(jī)制中都取得了重要的進(jìn)展。由于與人類(lèi)的近親關(guān)系，小鼠（Musmusculus）是人類(lèi)基因組研究最主要的模式生物之一，也是哺乳動(dòng)物研究領(lǐng)域最重要的模式生物，廣泛用于發(fā)育學(xué)、分子生物學(xué)、分子遺傳學(xué)、免疫學(xué)和生物醫(yī)學(xué)等研究領(lǐng)域［17］。小鼠為人類(lèi)疾病的研究，包括癌癥、動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、糖尿病、骨質(zhì)疏松和青光眼等作出巨大貢獻(xiàn)。同時(shí)，基因組的靶標(biāo)操作［18］、正向遺傳突變篩選［19］和體外成像技術(shù)［20］的高速發(fā)展也使小鼠成為干細(xì)胞研究的主要模式生物之一。

2 斑馬魚(yú)作為模式生物的優(yōu)越性

作為模式生物，斑馬魚(yú)（Danio rerio）不僅有脊椎生物的一般特點(diǎn)，而且具備諸多技術(shù)優(yōu)勢(shì)：飼養(yǎng)簡(jiǎn)單、成本較低、繁殖力強(qiáng)、胚胎透明、個(gè)體較小、時(shí)代時(shí)間短、遺傳信息豐富、擁有大量實(shí)驗(yàn)室突變系、可進(jìn)行正向和反向遺傳分析等［21，22］。

斑馬魚(yú)個(gè)體較小，可以在較小的空間里繁殖高密度的種群，利于節(jié)省試驗(yàn)成本。時(shí)代時(shí)間較短，僅3-4個(gè)月，有助于長(zhǎng)期的遺傳學(xué)研究。實(shí)驗(yàn)室條件下，斑馬魚(yú)可常年產(chǎn)卵，允許連續(xù)大規(guī)模繁殖后代。通常，雌性每周可產(chǎn)卵一次，每次產(chǎn)卵50-200枚。胚胎發(fā)育快，受精后24 h（hpf）身體成型，大部分器官96 hpf內(nèi)發(fā)育完全。斑馬魚(yú)胚胎個(gè)體小，可在微孔反應(yīng)板上培養(yǎng)；與哺乳動(dòng)物胚胎在子宮內(nèi)發(fā)育的情況不同，斑馬魚(yú)是體外發(fā)育（圖 1），便于人工操作，如通過(guò)控制培養(yǎng)液直接對(duì)胚胎進(jìn)行水處理（water treatment）；胚胎透明度高，且發(fā)育快速，易于觀察，適于進(jìn)行顯微注射。斑馬魚(yú)全基因組測(cè)序已于2005年完成（http：//zebrafish.org/zirc/home/guide.php），豐富的遺傳信息為確定斑馬魚(yú)各種生物學(xué)參數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)值、鑒定試驗(yàn)突變體提供了依據(jù)?；趯?shí)驗(yàn)室研究的迅速發(fā)展，現(xiàn)已獲得多種具有不同特性的斑馬魚(yú)突變品系，能滿足不同試驗(yàn)需求［23］。

圖1 斑馬魚(yú)體外受精

豐富的遺傳信息、充足的突變體材料和多種技術(shù)優(yōu)勢(shì)使斑馬魚(yú)成為脊椎生物發(fā)育學(xué)、遺傳學(xué)、生態(tài)學(xué)、基礎(chǔ)生物醫(yī)藥學(xué)、毒理學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域的優(yōu)秀模式生物。（1）斑馬魚(yú)體外受精，胚胎透明度高，可活體觀察表型變化，進(jìn)行表型篩選 。（2）高度的光學(xué)透明性也允許在保持胚胎完整的條件下，甚至活體條件下，對(duì)相關(guān)基因的時(shí)空表達(dá)模式進(jìn)行觀察分析。如通過(guò)整體胚胎原位雜交技術(shù)檢測(cè)基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達(dá)［24］，或通過(guò)免疫組化技術(shù)檢測(cè)基因翻譯產(chǎn)物的表達(dá)，其他技術(shù)如RT-PCR、免疫共沉淀也可用于斑馬魚(yú)基因表達(dá)信息研究［25］。（3）后代數(shù)目大、胚胎體積小、發(fā)育快，允許斑馬魚(yú)用于高通量篩選，而且許多人類(lèi)疾病在胚胎早期即表現(xiàn)病變性狀［26］，其在表形篩選方面的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)使斑馬魚(yú)成為發(fā)現(xiàn)新藥的有效藥理學(xué)工具［27］。（4）斑馬魚(yú)還用于研究傳染性和遺傳性人類(lèi)疾病的研究，如分歧桿菌?。?8］和神經(jīng)性疾?。?9］。（5）可利用斑馬魚(yú)進(jìn)行正向遺傳篩選發(fā)現(xiàn)疾病中基因的新功能。斑馬魚(yú)是迄今為止唯一能進(jìn)行大規(guī)模正向遺傳篩選的脊椎動(dòng)物［30］。（6）斑馬魚(yú)也是常用的脊椎動(dòng)物毒理學(xué)模型，用作生態(tài)毒理學(xué)測(cè)試物種，檢測(cè)水質(zhì)中化學(xué)物質(zhì)對(duì)魚(yú)類(lèi)生存、生長(zhǎng)和繁殖狀況的影響。但基于動(dòng)物權(quán)益維護(hù)和環(huán)境保護(hù)的需要，目前斑馬魚(yú)胚胎毒理學(xué)測(cè)試僅作為備用手段用于減少或代替實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè) 。

但實(shí)驗(yàn)室養(yǎng)殖斑馬魚(yú)也有困難，該種群易發(fā)生微孢子蟲(chóng)病和分枝桿菌病，這兩種難治愈且不易根除的傳染性疾?。?1］。此外，斑馬魚(yú)生物學(xué)和生態(tài)學(xué)的信息還十分有限［32］，基因組數(shù)據(jù)庫(kù)也不完善，不能滿足當(dāng)前研究的需要。目前斑馬魚(yú)的反向遺傳學(xué)手段應(yīng)用較少，使用特殊設(shè)計(jì)并合成的嗎啉代寡聚核糖核酸（morpholino）可以暫時(shí)性的抑制目的基因的表達(dá)。

3 斑馬魚(yú)轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)狀

20世紀(jì)80年代，中國(guó)科學(xué)院朱作言領(lǐng)導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)室在世界上率先開(kāi)展了魚(yú)類(lèi)基因工程定向育種研究，建立了完整的轉(zhuǎn)基因魚(yú)理論模型和完善的試驗(yàn)技術(shù)體系，為轉(zhuǎn)基因魚(yú)育種奠定了理論基礎(chǔ)［33］。30年來(lái)，斑馬魚(yú)轉(zhuǎn)基因技術(shù)的迅速發(fā)展為斑馬魚(yú)基礎(chǔ)理論研究和實(shí)際應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。目前，實(shí)驗(yàn)室有幾種技術(shù)成功用于斑馬魚(yú)轉(zhuǎn)基因研究。

3.1 顯微注射技術(shù)

斑馬魚(yú)胚胎顯微注射技術(shù)是進(jìn)行基因瞬時(shí)表達(dá)、過(guò)量表達(dá)、降低表達(dá)、制備轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)或誘發(fā)突變的重要手段，該方法操作相對(duì)簡(jiǎn)單、效果可靠，是斑馬魚(yú)轉(zhuǎn)基因研究的主要方法，獲得轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)種系的頻率為10%-30%［34］。一般認(rèn)為，質(zhì)粒DNA注射到受精卵細(xì)胞質(zhì)后立即形成大分子量多聯(lián)體（concatemers），并可能參與基因重組［35］。但是外源基因的多聯(lián)體整合，容易為染色體內(nèi)重組提供條件，最終可能導(dǎo)致外源基因表達(dá)的改變。

3.2 GAL4/UAS系統(tǒng)和Tol2轉(zhuǎn)座子

顯微注射技術(shù)通常使用含標(biāo)記蛋白的質(zhì)粒載體（如pEGFP-N1），現(xiàn)在一些其他類(lèi)型的載體也用于斑馬魚(yú)轉(zhuǎn)基因研究。GAL4/UAS轉(zhuǎn)錄激活系統(tǒng)可以同時(shí)表達(dá)兩個(gè)外源基因，以提高其在宿主細(xì)胞中表達(dá)水平［36］，并越來(lái)越多的用于斑馬魚(yú)基因調(diào)控和轉(zhuǎn)錄沉默機(jī)制的研究。通常斑馬魚(yú)中使用的Tol2轉(zhuǎn)座子去除了內(nèi)部原有的轉(zhuǎn)座酶編碼區(qū)域并用EGFP基因序列代替，注射時(shí)將其與轉(zhuǎn)座酶一起轉(zhuǎn)到斑馬魚(yú)受精卵中，轉(zhuǎn)座酶以一定幾率完整切割轉(zhuǎn)座元件，這些轉(zhuǎn)座元件隨之整合到斑馬魚(yú)基因組中。有學(xué)者將Gal4/UAS與Tol2元件聯(lián)合使用，成功實(shí)現(xiàn)了斑馬魚(yú)基因組水平上的插入表達(dá)［37］。

3.3 擬型反轉(zhuǎn)錄病毒和桿狀病毒介導(dǎo)法

擬型反轉(zhuǎn)錄病毒也已經(jīng)成功用于斑馬魚(yú)研究，它的插入效率比Tol2轉(zhuǎn)座子更高，而且與顯微注射相比，使用該方法得到的轉(zhuǎn)基因奠基者（transgenic founder）之間表達(dá)范圍的差異性比較小。盡管如此，由于逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)基因技術(shù)所需的構(gòu)建、包裝、效價(jià)評(píng)定和轉(zhuǎn)染耗時(shí)較長(zhǎng)，因此該技術(shù)不能用于常規(guī)轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)的構(gòu)建和啟動(dòng)子及基因功能的分析［38］。重組桿狀病毒介導(dǎo)法是一種更新的方法。桿狀病毒可以高效地轉(zhuǎn)導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞，Huang等［39］對(duì)桿狀病毒加以改進(jìn)：使用巨細(xì)胞病毒早早期啟動(dòng)子（CMV-IE），以加強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）作報(bào)告基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組桿狀病毒可以將外源基因高效地導(dǎo)入已分化的魚(yú)類(lèi)細(xì)胞，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞培養(yǎng)15 d內(nèi)熒光持續(xù)較高亮度，繼續(xù)培養(yǎng)一段時(shí)間可觀察到熒光細(xì)胞的數(shù)目并未減少。

3.4 熒光標(biāo)記

圖2 轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)（5 dpf，受精后5 d）在激發(fā)光下表達(dá)熒光

隨著綠色熒光蛋白（GFP）的發(fā)現(xiàn)及其晶體結(jié)構(gòu)的破解，GFP越來(lái)越多地作為報(bào)告基因用于轉(zhuǎn)基因研究。除野生型GFP外，現(xiàn)已發(fā)展了3種突變體，EGFP、GFP-S65T和RS-GFP［40］。GFP作為報(bào)告基因無(wú)需底物，現(xiàn)象明顯易于觀察，反應(yīng)更敏感，成為轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)報(bào)告基因的理想選擇（圖2）。2003年，新加坡國(guó)立大學(xué)宮之遠(yuǎn)教授成功將綠色、紅色、黃色和橙色熒光蛋白與肌肉特異性mylz-2啟動(dòng)子融合，成功構(gòu)建了在骨骼肌高度表達(dá)熒光蛋白的各色轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)品系，日光和紫外燈下都可以肉眼觀察到轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)發(fā)出熒光［41］。

4 轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)的應(yīng)用前景

由于胚胎體積小、透明度高、發(fā)育快等特點(diǎn)，斑馬魚(yú)成為研究脊椎動(dòng)物基因表達(dá)調(diào)控和發(fā)育分化、形態(tài)發(fā)生、人類(lèi)疾病、藥物篩選和環(huán)境檢測(cè)等領(lǐng)域最重要的模式生物之一。

4.1 轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)用于基因表達(dá)和發(fā)育調(diào)控研究

以斑馬魚(yú)為模式生物，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，科學(xué)家們對(duì)脊椎動(dòng)物熱生物學(xué)進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，包括溫度對(duì)斑馬魚(yú)生長(zhǎng)發(fā)育、繁殖和性別分化的影響，溫度對(duì)生理節(jié)律、動(dòng)物行為的調(diào)節(jié)，溫度對(duì)基因表達(dá)（如熱激蛋白）的影響等。此外，對(duì)生物鐘系統(tǒng)、細(xì)胞周期、神經(jīng)發(fā)育學(xué)都有廣泛的研究。孟安明，林碩［42］利用斑馬魚(yú)GATA-2基因5'側(cè)翼調(diào)控序列和GFP基因，獲得了只在中樞神經(jīng)細(xì)胞表達(dá)GFP或在神經(jīng)細(xì)胞和表層細(xì)胞都表達(dá)GFP的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)種系，同時(shí)還進(jìn)一步證實(shí)了GATA-2基因在胚胎發(fā)育中的時(shí)空表達(dá)譜。

4.2 活體形態(tài)發(fā)生和細(xì)胞遷移研究

為觀察胰外分泌腺細(xì)胞的分化、增殖和形態(tài)發(fā)生，用彈性蛋白酶A啟動(dòng)子調(diào)控GFP在斑馬魚(yú)胰腺外分泌腺中特異性表達(dá)，發(fā)現(xiàn)胰腺在發(fā)育早期是一個(gè)緊密結(jié)合的實(shí)體，然后沿腸向后延伸［43］。Kawakami等［44］將GFP融合斑馬魚(yú)nanos1基因3' UTR，合成RNA后注射到幾種硬骨魚(yú)體內(nèi)，成功觀察到原生殖細(xì)胞向生殖脊遷移，但是這種方法目前并不能適用于所有硬骨魚(yú)類(lèi)。

4.3 人類(lèi)免疫性疾病、自體吞噬和神經(jīng)性疾病的研究

斑馬魚(yú)遺傳操作簡(jiǎn)單，已經(jīng)成功用于多種人類(lèi)疾病模型的構(gòu)建，在研究人類(lèi)疾病發(fā)病機(jī)理、治療手段等方面作出了卓越貢獻(xiàn)。例如，通過(guò)斑馬魚(yú)啟動(dòng)子表達(dá)顯性突變基因，構(gòu)建熒光重組體，瞬時(shí)過(guò)表達(dá)和反義基因敲除技術(shù)的應(yīng)用，對(duì)人類(lèi)中央核性疾病、亨廷頓舞蹈癥、多谷氨酰胺疾病和老年癡呆癥等多種疾病進(jìn)行了深入研究［45］。

4.4 熒光魚(yú)篩查突變體、阻斷特殊發(fā)育途徑的小分子或抑制正常發(fā)育的毒素

Wan等［43］將elaA：gfp轉(zhuǎn)入猥因子接受缺陷型斑馬魚(yú)突變體slow muscle omitted，發(fā)現(xiàn)猥因子為外分泌腺形態(tài)發(fā)生所必需，但不影響細(xì)胞分化。對(duì)該轉(zhuǎn)基因品系進(jìn)行嗎菲林基因敲除和毒劑介導(dǎo)的細(xì)胞切除，發(fā)現(xiàn)胰腺外分泌腺發(fā)育依賴Islet-1基因。注射elaA啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的白喉毒素DTA導(dǎo)致外分泌細(xì)胞選擇性消融，但內(nèi)分泌腺和其他內(nèi)胚層發(fā)育來(lái)的器官不受影響。該研究成功揭示了猥因子和白喉毒素對(duì)胰腺正常發(fā)育的重要影響?；驘晒鈽?biāo)記魚(yú)類(lèi)與反求遺傳學(xué)方法聯(lián)合起來(lái)可以分析在特殊的發(fā)育途徑中已知基因的作用規(guī)律。

4.5 轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)用于生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外運(yùn)用轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)檢測(cè)水體環(huán)境中的重金屬毒性、環(huán)境激素、綜合毒性和有機(jī)污染物毒性等，成效顯著，日益受到關(guān)注。目前主要通過(guò)3種途徑使用轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)對(duì)環(huán)境污染物進(jìn)行監(jiān)測(cè)［46］。第一種方法是使用整合了大量大腸桿菌穿梭載體的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)檢測(cè)環(huán)境誘變劑，如以熒光定位的轉(zhuǎn)換來(lái)測(cè)試誘變劑的活性；第二種方法是使用受到不同環(huán)境污染物，如芳烴、重金屬或環(huán)境雌激素污染影響的啟動(dòng)調(diào)控元件，利用該元件誘導(dǎo)熒光或熒光酶的表達(dá)；第三種方法是利用組織特異性表達(dá)的熒光魚(yú)篩選隨特殊發(fā)育途徑產(chǎn)生特殊作用的環(huán)境毒素。

在受熱、重金屬等壓力脅迫條件下，生物體細(xì)胞中的熱激蛋白HSP會(huì)在保護(hù)和修復(fù)途徑中發(fā)揮重要作用。Seok等［47］利用斑馬魚(yú)轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究硫酸銅對(duì)人類(lèi)HSP70啟動(dòng)子的特異性激活，表明斑馬魚(yú)可以作為轉(zhuǎn)基因生物傳感器檢測(cè)環(huán)境中的異生毒性物質(zhì)。紀(jì)喜文等［48］構(gòu)建了一種GFP 轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)報(bào)告系統(tǒng)。利用芳香烴反應(yīng)元件AHRDtk 控制報(bào)告基因綠色熒光蛋白在斑馬魚(yú)體內(nèi)的表達(dá)，通過(guò)顯微鏡觀察轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)體內(nèi)的綠色熒光表達(dá)情況，可以直觀判斷水環(huán)境中是否含有該類(lèi)化學(xué)物質(zhì)。上海復(fù)旦大學(xué)的研究人員［49］經(jīng)過(guò)多年研究，成功構(gòu)建了卵黃蛋白原1（vtg1）啟動(dòng)子調(diào)控綠色熒光蛋白表達(dá)的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)品系，可以簡(jiǎn)便直觀快速地監(jiān)測(cè)環(huán)境中的雌激素類(lèi)物質(zhì)，如β-雌二醇（E2）、氯化鎘（CdCl2）、玉米烯酮和雌三醇（E3）等。

5 斑馬魚(yú)轉(zhuǎn)基因技術(shù)待解決的問(wèn)題

由于斑馬魚(yú)基因組為二倍體，目前鑒定到的許多同源基因，尚不能確定是真正的同源基因還是由于注釋不完整而對(duì)同一基因的不同解釋?zhuān)园唏R魚(yú)數(shù)據(jù)庫(kù)亟待完善。斑馬魚(yú)轉(zhuǎn)基因技術(shù)最主要的問(wèn)題仍然是基因轉(zhuǎn)化效率問(wèn)題。目前最可靠、最普遍的方法是顯微注射，該方法對(duì)操作人員的技術(shù)水平要求很高，在操作精確的條件下，轉(zhuǎn)化率最高也僅維持在30%左右。另一個(gè)問(wèn)題是嵌合體問(wèn)題。由于基因整合的隨機(jī)性和多樣性，轉(zhuǎn)基因魚(yú)親本是攜帶外源基因的嵌合體，外源基因在各個(gè)性腺細(xì)胞基因組內(nèi)的整合的數(shù)量與位點(diǎn)不盡相同，由此導(dǎo)致子代群體在攜帶外源基因（包括數(shù)量和整合位點(diǎn)）上出現(xiàn)分離［33］。其他問(wèn)題包括因使用其他物種的啟動(dòng)子序列可能導(dǎo)致的轉(zhuǎn)基因沉默，外源基因整合位點(diǎn)的隨機(jī)性，外源基因整合形成多聯(lián)體等。

綜上所述，斑馬魚(yú)因具有體積小、代時(shí)短、胚胎透明、體外發(fā)育等獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，使之成為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究領(lǐng)域最重要的模式生物之一，在研究基因表達(dá)、發(fā)育調(diào)控、形態(tài)發(fā)生、細(xì)胞遷移、人類(lèi)疾病、發(fā)育毒素、環(huán)境監(jiān)測(cè)、藥物篩選等領(lǐng)域作出巨大貢獻(xiàn)。作為新型模式生物，轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)在各領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用的同時(shí)，其理論研究和操作技術(shù)都亟待發(fā)展：外源基因在斑馬魚(yú)胚胎細(xì)胞內(nèi)的重組機(jī)制尚不明確；基因轉(zhuǎn)化效率有待提高；轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)體系的代系維持需要加強(qiáng)，同時(shí)還需要尋找更加高效靈敏的報(bào)告基因。隨著研究理論和技術(shù)手段的日趨成熟，模式生物斑馬魚(yú)研究將引起更多關(guān)注并在更多的科學(xué)研究中發(fā)揮重要作用。

致謝：感謝中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所吳乃虎研究員在本文寫(xiě)作過(guò)程中給予指導(dǎo)和修正；感謝北京大學(xué)生命科學(xué)院張博實(shí)驗(yàn)室在試驗(yàn)研究過(guò)程中給予大力支持與幫助。

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