張淑蘭，王國(guó)軍，唐輝，劉艷芳，王幻，關(guān)麗 （.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)醫(yī)院藥劑科，新疆 烏魯木齊83000；.新疆特種植物藥資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子大學(xué)藥學(xué)院，新疆 石河子8300）

核 桃 隔 膜（diaphragma of Juglans regia L.）又 名 分 心木，為胡桃科胡桃屬植物核桃（Juglans regia L.）的帶骨質(zhì)內(nèi)果皮的種隔，系新疆維吾爾族民間用藥，用于治療遺精、遺尿、尿路感染、腎虛遺精、陽痿早泄等癥狀［1－2］?；瘜W(xué)研究表明核桃隔膜含有黃酮類物質(zhì)、生物堿、皂苷、有機(jī)酸、揮發(fā)油及氨基酸等成分［3］，鑒于黃酮類成分的藥理活性和本課題組前期的研究表明，黃酮類化合物可能是核桃隔膜中重要的活性成 分［4－5］。

近年來國(guó)內(nèi)外對(duì)核桃仁、葉、花、青皮的研究已趨于成熟［6－8］，但對(duì)核桃隔膜的開發(fā)利用還相對(duì)較少，為了深入分析核桃隔膜的有效成分，更全面地評(píng)價(jià)這一植物資源，本文建立了測(cè)定黃酮苷含量的高效液相色譜方法，并采用直接測(cè)定主成分木犀草苷與間接測(cè)定水解后苷元換算成黃酮苷相結(jié)合的方式測(cè)定核桃隔膜中黃酮苷的含量，并比較了不同產(chǎn)地核桃隔膜中黃酮苷含量的差異，為核桃隔膜的的質(zhì)量控制提供有效的理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 美國(guó)Agilent HP1100型高效液相色譜系統(tǒng)（配有：四元泵，紫外可變波長(zhǎng)檢測(cè)器，ChemStations 色譜工作站）；API4000三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（Applied Biosystems，USA）；德國(guó)Sartorius BP211D 十萬分之一電子分析天平；上海科導(dǎo)SK5200HP超聲清洗器。

1.2 試劑 對(duì)照品槲皮素（批號(hào)100081－200406）、山柰素（批號(hào)110861－200606）、木犀草素（批號(hào)111520－200504）、木犀草苷（批號(hào)111720－201106）均購于中國(guó)食品藥品檢定研究院。甲醇、乙腈為色譜純，水為純凈水，醋酸、乙醇、鹽酸及其他試劑均為分析純；核桃隔膜購自烏魯木齊及大理藥材市場(chǎng)。

2 方法與結(jié)果

2.1 試驗(yàn)條件

2.1.1 黃酮苷色譜條件 Waters C18柱（150 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相是乙腈～0.4%醋酸水；0～10 min乙腈14%～24%，10～30 min乙腈24%～61%，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；柱溫25 ℃；流速1.0mL·min－1；進(jìn)樣量20μL。

2.1.2 黃酮苷質(zhì)譜條件 質(zhì)譜掃描方式ESI（－）；掃描范圍250～700 amu；離子源溫度650 ℃；碰撞氣流速5 psi；離子源電噴霧電壓－4 500 V；霧化器電流GS150 psi、GS260 psi；去簇電壓DP－40 V、EP－40 V；碰撞能量－35 V，碰撞出口電壓－6 V。干燥氣體為N2。

結(jié)合LC－MS圖譜及標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)確定確定相對(duì)分子質(zhì)量為447.0的為木犀草苷，見圖1、圖2，而樣品中的蘆丁含量無法準(zhǔn)確定量，結(jié)果見圖3。在此條件下，樣品中的木犀草苷與相鄰組分分離度良好，結(jié)果見圖3。

圖1 樣品的HPLC－MS圖Fig 1 HPLC－MS chromatogram of sample

2.1.3 黃酮苷元的色譜條件 Waters C18柱（150 mm×4.6 mm，5μm）；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；溫度25 ℃；流動(dòng)相為甲醇－乙腈－0.4%磷酸溶液組成，見表1。在此色譜條件下，樣品中各組分的色譜峰分離度良好，槲皮素、木犀草素及山柰素的保留時(shí)間分別是13.744，14.855，17.163 min，結(jié)果見圖4。

圖2 木犀草苷的離子提取圖Fig 2 Ion extraction chromatogram of of luteoloside

圖3 核桃隔膜HPLC圖A.對(duì)照品；B.樣品；1－蘆??；2－木犀草苷Fig 3 HPLC chromatograms of sampleA.reference substance；B.sample；1－lutin；2－luteoloside

表1 HPLC梯度條件Tab 1 HPLC elution conditions

圖4 苷元HPLC色譜圖A.對(duì)照品；B.樣品；1－槲皮素；2－木犀草素；3－山柰素Fig 4 HPLC chromatograms of flavone aglyconsA.reference substance；B .sample；1－quercetin；2－luteolin；3－kaempferide

2.2 對(duì)照品溶液的配制 分別精密稱取槲皮素，木犀草素及山柰素對(duì)照品5.67，6.54，4.06 mg，用甲醇溶解稀釋成質(zhì)量濃度為113.4，130.8，81.2μg·mL－1的對(duì)照品儲(chǔ)備液，搖勻，備用。另外精密稱取木犀草苷5.04 mg，用甲醇溶解稀釋成質(zhì)量濃度100.8μg·mL－1的對(duì)照品儲(chǔ)備液，搖勻，備用。

2.3 樣品溶液的配制 稱取核桃隔膜100 g粉碎（過3號(hào)篩），60%乙醇超聲提取2次，濃縮干燥得核桃隔膜黃酮提取物9.8 g。稱取核桃隔膜黃酮提取物75 mg，加甲醇30 mL，體積分?jǐn)?shù)為25%鹽酸溶液5 mL 置于150 mL 錐形瓶中，在95 ℃水浴中回流水解90 min，冷卻，轉(zhuǎn)移至50 mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。另取未水解的核桃隔膜黃酮提取物適量，加甲醇溶解定容至25 mL，搖勻，備用。

2.4 線性關(guān)系考察 精密移取槲皮素，木犀草素及山柰素混合對(duì)照品及木犀草苷溶液0.5，1，2，3，4，5，6 mL 分別置于10 mL的量瓶中，用甲醇稀釋定容，搖勻，0.45μm 微孔濾膜濾過，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以色譜圖峰面積（A）為縱坐標(biāo)，濃度（C）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性方程見表2，結(jié)果表明3種苷元及木犀草苷的線性關(guān)系良好。

表2 線性關(guān)系Tab 2 Linear relationship

2.5 精密度試驗(yàn) 精密移取混合對(duì)照品及木犀草苷溶液20 μL，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定6次，記算槲皮素、木犀草素、山柰素及木犀草苷峰面積的RSD 分別為1.1%、1.0%、1.0%、0.2%，說明儀器的精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取新疆核桃隔膜6 份，精密稱定，按“2.3”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，精密吸取20μL 進(jìn)樣測(cè)定，記錄樣品中槲皮素、木犀草素、山柰素及木犀草苷峰面積的RSD 分別為1.6%、1.7%、2.0%、1.7%，結(jié)果表明本 方法的重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同批樣品溶液20μL，分別于0，2，4，6，8，12 h在上述色譜條件下進(jìn)樣分析。計(jì)算槲皮素、木犀草素、山柰素及木犀草苷峰面積的RSD 分別為2.4%、1.6%、1.7%、1.1%，表明樣品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取同批核桃隔膜黃酮提取物30 mg，分別加入6 mL、0.113 4 mg·mL－1的槲皮素，5 mL 0.081 26 mg·mL－1的山柰素，4 mL、0.130 8 mg·mL－1的木犀草素及2 mL、0.100 8 mg·mL－1的對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn) 溶 液，按“2.3”項(xiàng)處理方法制備樣品溶液6 份，在上述色譜條件下測(cè)定加樣回收率。結(jié)果槲皮素、木犀草素、山柰素及木犀草苷的平均回收率分別為94.86%、93.89%、103.90%、104.0%；RSD 分別為1.9%、2.7%、3.2%、1.1%。

2.9 樣品測(cè)定 取兩個(gè)產(chǎn)地的樣品，分別按“2.3”項(xiàng)下方法制得樣品溶液，分別精密吸取對(duì)照品溶液與樣品溶液各20 μL，進(jìn)樣分析。采用外標(biāo)法分別計(jì)算槲皮素、木犀草素、山柰素及木犀草苷含量，按下式將苷元換算成黃酮苷的的含量［9］，結(jié)果見表3。

黃酮苷含量＝槲皮素量×1.44＋木犀草素量×1.57＋山柰素量×1.39

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果Tab 3 Results of determination

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法測(cè)定核桃隔膜中黃酮苷的含量，相比以蘆丁為對(duì)照品的比色法測(cè)定黃酮苷更加準(zhǔn)確、重現(xiàn)性更好。實(shí)驗(yàn)中采用LC－MS對(duì)核桃隔膜中的黃酮類物質(zhì)（保留時(shí)間為11.117 min的化合物）進(jìn)行分析研究，對(duì)該化合物進(jìn)行MS分析得到分子質(zhì)量為447.0（木犀草苷對(duì)照品分子質(zhì)量448.376 9）（見圖1），并對(duì)該化合物進(jìn)行離子提取，得到單一的圖譜（見圖2），通過HPLC保留時(shí)間和分子質(zhì)量與已知對(duì)照品的對(duì)比確定該化合物為木犀草苷（圖3）；而黃酮提取物水解后的苷元樣品經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比確定黃酮提取物中主要有槲皮素、木犀草素、山柰素。

黃酮苷水解受溶液pH 值、水浴溫度、水解時(shí)間等因素的影響。文獻(xiàn)［10］中水解用的酸多有不同，且水解時(shí)間、溫度各有不同，時(shí)間從0.5～2 h不等，溫度80～110 ℃也不等。經(jīng)試驗(yàn)，以甲醇－25%鹽酸（6∶1）混合液95 ℃水解1.5 h為最佳水解條件。

核桃隔膜黃酮提取物的水解樣品中主要為槲皮素，木犀草素和山柰素3種苷元。核桃隔膜黃酮提取物中以木犀草素為苷元的苷為木犀草苷，槲皮素為苷元的苷代表有扁蓄苷，以山柰素為苷元的苷有胡桃苷，故可用相對(duì)分子質(zhì)量為434的扁蓄苷對(duì)槲皮素的轉(zhuǎn)換因子1.44，分子質(zhì)量為448的木犀草苷對(duì)木犀草素的轉(zhuǎn)換因子1.57和分子質(zhì)量為418的胡桃苷對(duì)山柰素轉(zhuǎn)換因子1.39，通過下面的轉(zhuǎn)換關(guān)系來計(jì)算核桃隔膜黃酮提取物中黃酮苷的含量（黃酮苷含量＝槲皮素量×1.44＋木犀草素量×1.57＋山柰素量×1.39）。

通過直接測(cè)定黃酮主成分木犀草苷含量與間接測(cè)定黃酮苷的含量比較發(fā)現(xiàn)，直接測(cè)得木犀草苷含量3.015 mg·g－1，間接測(cè)得黃酮苷含量8.56 mg·g－1，木犀草苷含量最高，可以作為總黃酮苷含量評(píng)價(jià)的主要指標(biāo)；經(jīng)過木犀草素?fù)Q算的黃酮苷含量5.68 mg·g－1，而木犀草苷含量3.015 mg·g－1，說明樣品中以木犀草素為苷元的苷除了木犀草苷外還有其他黃酮苷。本實(shí)驗(yàn)還比較了新疆與云南不同品種的核桃隔膜中黃酮苷的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)新疆產(chǎn)地的含量更高。

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