胡俊杰，肖伊，王桂紅，鄭國華 （.湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北 武漢430065；.孝感市孝南區(qū)食品藥品監(jiān)督管理局，湖北孝感43000）

活血消癭片是根據(jù)湖北中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院陳如泉教授的臨床經(jīng)驗(yàn)方，自主研發(fā)而成的中藥復(fù)方制劑，具有活血通絡(luò)、消癭化結(jié)之功效，臨床上主要用于治療結(jié)節(jié)性甲狀腺腫［1］。處方由桃仁、莪術(shù)、柴胡等8味中藥組成，其中，莪術(shù)、柴胡均含有揮發(fā)油，且是主要活性成分［2－4］。為將該制劑開發(fā)成現(xiàn)代中成藥，減少揮發(fā)油損失，增加其在制劑生產(chǎn)和貯存過程中的穩(wěn)定性，保證藥效，本研究利用β－環(huán)糊精對(duì)揮發(fā)油進(jìn)行包合。

目前，國內(nèi)數(shù)理統(tǒng)計(jì)往往采用正交設(shè)計(jì)或均勻設(shè)計(jì)［5］，尋求最佳的因素水平組合，但不能在給出的整個(gè)區(qū)域上找到因素和響應(yīng)值之間的一個(gè)明確的函數(shù)表達(dá)式，從而無法找到整個(gè)區(qū)域上的因素的最佳組合和響應(yīng)的最優(yōu)值。Box－Behnken效應(yīng)面法是統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)試驗(yàn)技術(shù)的合成，利用Box－Behnken 的試驗(yàn)設(shè)計(jì)并通過試驗(yàn)得到一定數(shù)據(jù)，采用多元二次方程來擬合因素和效應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過對(duì)回歸方程的分析來尋求最優(yōu)工藝參數(shù)，解決多變量問題的一種統(tǒng)計(jì)方法［6］。本實(shí)驗(yàn)采用采用單因素試驗(yàn)結(jié)合Box－Behnken效應(yīng)面法優(yōu)選活血消癭片中揮發(fā)油的最佳包合工藝條件。

1 材料

Mettler－Toledo AG285 型 分 析 天 平（Mettler－ToledoGmbH，Laboratory ＆ Weighing Technologies，Switzerland）；無水乙醇為分析純，水為自制重蒸水；β－環(huán)糊精（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)F20100614）；揮發(fā)油提取制備工藝：按處方比例取莪術(shù)、柴胡兩味藥材，補(bǔ)足其1倍吸水量后，加入8倍量的水浸泡3h，運(yùn)用中國藥典2010年版一部附錄XD 方法提取揮發(fā)油6h，用無水乙醇萃取，取乙醇層用無水硫酸鈉干燥過夜，濾去無水硫酸鈉，揮去乙醇，得揮發(fā)油備用。處方中各藥材購自湖北天濟(jì)中藥飲片有限公司，經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)生藥教研室陳科力教授鑒定均為正品。

2 方法與結(jié)果

2.1 評(píng)價(jià)指標(biāo) 篩選指標(biāo)：包合率。

揮發(fā)油的包合率＝包合物中實(shí)際含油量（mL）／［揮發(fā)油投入量（mL）×空白回收率］×100%

揮發(fā)油空白回收率＝收集揮發(fā)油的量／加入揮發(fā)油的量×100%

揮發(fā)油空白回收率測(cè)定：精密量取揮發(fā)油1.0 mL置于500mL圓底燒瓶中，加入純化水250mL，按中國藥典2010年版一部附錄揮發(fā)油測(cè)定法甲法［5］測(cè)定揮發(fā)油量，經(jīng)3次測(cè)定，計(jì)算空白回收率為95%。

2.2 包合方法的選擇［8］通過預(yù)試驗(yàn)和結(jié)合文獻(xiàn)，本實(shí)驗(yàn)主要對(duì)飽和水溶液法和超聲法進(jìn)行比較研究。

2.2.1 飽和水溶液法 取1mL揮發(fā)油，用4mL無水乙醇溶解。稱取6gβ－環(huán)糊精，置150mL具塞錐形瓶中，加100mL的純化水，水浴加熱使溶解，自然冷卻至50℃，置控溫磁力攪拌器上邊攪拌邊滴加揮發(fā)油乙醇溶液，加塞繼續(xù)攪拌1h，平行操作3次。

2.2.2 超聲法 取1mL 揮發(fā)油，用4mL 無水乙醇溶解。稱取6gβ－環(huán)糊精，置150mL具塞錐形瓶中，加100mL的純化水，水浴加熱使溶解，自然冷卻至50 ℃，置50kHz超聲清洗儀中邊超聲邊滴加揮發(fā)油乙醇溶液，加塞繼續(xù)超聲1h，平行操作3次。

2.2.3 包合物的制備及揮發(fā)油的測(cè)定 分別將上述2種方法制得的包合物溶液置冰箱中，冷藏12h，抽濾，少量水洗，抽至近干，再無水乙醇洗滌至無揮發(fā)油氣味，干燥，即得β－環(huán)糊精 包合物。將制得的包合物置于500 mL 圓底燒瓶中，加入純化水250 mL，測(cè)定揮發(fā)油量。

2.2.4 包合方法的選擇試驗(yàn)結(jié)果 采用超聲法和飽和水溶液法包合工藝所得的揮發(fā)油平均包合率分別為57.05%和63.16%。飽和水溶液法的包合效果較好，因此采用飽和水溶液法進(jìn)行包合。

2.3 單因素試驗(yàn)初步優(yōu)化飽和水溶液法包合工藝

2.3.1 β－環(huán)糊精加入量對(duì)包合工藝的影響 固定包合溫度為50 ℃，包合時(shí)間為1h，以揮發(fā)油－β－環(huán)糊精（mL∶g）的量對(duì)揮發(fā)油包合率的影響進(jìn)行單因素試驗(yàn)。設(shè)計(jì)揮發(fā)油－β－環(huán)糊精（mL∶g）為1∶2，1∶4，1∶6，1∶8，1∶10，結(jié)果見圖1。

圖1 β－環(huán)糊精加入量對(duì)包合工藝的影響（n＝3）Fig 1 Effects ofβ－CD addition amount on inclusion process（n＝3）

由圖1可知，揮發(fā)油－β－環(huán)糊精在1∶2～1∶6之間時(shí)，隨著β－環(huán)糊精加入量的增加，揮發(fā)油包合率增加顯著；當(dāng)揮發(fā)油－β－環(huán)糊精（mL∶g）為1∶6時(shí)揮發(fā)油包合率達(dá)到最高值，后期趨于平緩。因此，選擇揮發(fā)油－β－環(huán)糊精（mL∶g）在1∶4～1∶8之間。

2.3.2 包合時(shí)間對(duì)包合工藝的影響 固定揮發(fā)油－β－環(huán)糊精（mL∶g）為1∶6，包合溫度為50 ℃，以包合時(shí)間對(duì)揮發(fā)油包合率的影響進(jìn)行單因素試驗(yàn)。設(shè)計(jì)包合時(shí)間分別為0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0h，結(jié)果見圖2。

圖2 包合時(shí)間對(duì)包合工藝的影響（n＝3）Fig 2 Effects of inclusion time on inclusion process（n＝3）

由圖2可知，隨著包合時(shí)間的延長，揮發(fā)油包合率提高，包合時(shí)間為2h時(shí)，包合率達(dá)到最高值。再延長包合時(shí)間，包合率有下降趨勢(shì)。因此，包合時(shí)間應(yīng)在1.5～2.5h之間。

2.3.3 包合溫度對(duì)包合工藝的影響 固定揮發(fā)油－β－環(huán)糊精（mL∶g）為1∶6，包合時(shí)間為2h，以包合溫度對(duì)揮發(fā)油包合率的影響進(jìn)行單因素試驗(yàn)。設(shè)計(jì)包合溫度分別為30，40，50，60，70 ℃，結(jié)果見圖3。

圖3 包合溫度對(duì)包合工藝的影響（n＝3）Fig 3 Effects of inclusion temperature on inclusion process（n＝3）

由圖3可知，隨著包合溫度的升高，在30～50℃之間，揮發(fā)油包合率顯著提高，包合溫度為50 ℃時(shí)，包合率達(dá)到最高值。再升高包合溫度，包合率反而下降。這可能是因?yàn)榘蠝囟鹊牟粩嗌?，使部分揮發(fā)油揮發(fā)，從而使包合率下降。因此，包合溫度應(yīng)在40～50 ℃之間。

2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化揮發(fā)油的包合工藝［11－13］

2.4.1 響應(yīng)面分析 采用軟件Design Excerpt 7.0.0中的Box－Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)三因素三水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)表1。三因素分別是揮發(fā)油－β－環(huán)糊精（mL∶g）（A）、包合時(shí)間（B）、包合溫度（C）。

表1 Box－Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素和水平Tab 1 Factors and levels of Box－Behnken design test

2.4.2 響應(yīng)面法優(yōu)化揮發(fā)油的包合工藝 以A、B、C為自變量，揮發(fā)油包合率Y 為響應(yīng)值（%），響應(yīng)面分析方案及結(jié)果見表2。

2.4.3 模型的建立及顯著性檢驗(yàn) 用ANOVA 分析響應(yīng)面的回歸參數(shù)。由表3可知，A、A2、B2、C2項(xiàng)達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）。C、AB 項(xiàng)達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。

利用Design－Expert軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到揮發(fā)油包合率對(duì)揮發(fā)油－β－環(huán)糊精（A）、包合時(shí)間（B）和包合溫度（C）的二次多項(xiàng)回歸模型：

表2 響應(yīng)面分析方案及結(jié)果Tab 2 Results of response surface analysis programme

式中，——Y 為揮發(fā)油包合率（%），A為揮發(fā)油－β－環(huán)糊精（g∶mL），B為包合時(shí)間（h），C為包合溫度（℃）。

該方程的相關(guān)系數(shù)R＝0.985 1。由表3方差分析結(jié)果可知，整體模型P＜0.01，方程模型達(dá)到極顯著，失擬項(xiàng)P＞0.05，不顯著，因此二次模型成立，應(yīng)用此方程可以預(yù)測(cè)揮發(fā)油的包合率及優(yōu)化飽和水溶液法包合揮發(fā)油工藝。

表3 響應(yīng)面二次回歸方程方差分析結(jié)果Tab 3 Results of variance analysis of response surface quadratic regression equation

2.5 包合工藝的響應(yīng)面分析與優(yōu)化 用Design－Expert軟件，根據(jù)回歸方程分析作響應(yīng)面圖4～6，圖4顯示在包合溫度50 ℃條件下，包合率隨揮發(fā)油－β－環(huán)糊精和包合時(shí)間的增加先迅速增大后緩慢減小，由此可見適當(dāng)?shù)脑龃髶]發(fā)油－β－環(huán)糊精和包合時(shí)間，可以一定程度的提高包合率。圖5顯示在包合時(shí)間2h條件下，包合率隨包合溫度的增大先增加后減小，包合率隨揮發(fā)油－β－環(huán)糊精的增加先迅速增大后緩慢減小。圖6顯示在揮發(fā)油－β－環(huán)糊精為1∶6條件下，包合率隨包合溫度的增大先增加后減小，包合率隨包合時(shí)間的增加先迅速增大后緩慢減小，因此，在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)慎重控制包合溫度，以獲得較高的包合率。

圖4 揮發(fā)油－β－環(huán)糊精與包合時(shí)間對(duì)包合率影響的效應(yīng)面Fig 4 Response surface plot for the effect ofβ－CD：volatile oil and inclusion time on response value of volatile oil inclusion rate

圖5 揮發(fā)油－β－環(huán)糊精與包合溫度對(duì)包合率影響的效應(yīng)面Fig 5 Response surface plot for the effect ofβ－CD：volatile oil and inclusion temperature on response value of volatile oil inclusion rate

圖6 包合溫度與包合時(shí)間對(duì)包合率影響的效應(yīng)面Fig 6 Response surface plot for the effect of inclusion temperature and inclusion time on response value of volatile oil inclusion rate

2.6 揮發(fā)油包合工藝條件 結(jié)合二次回歸模型的數(shù)學(xué)分析結(jié)果，利用Design－Expert軟件對(duì)二次回歸方程求解，得最佳工藝條件為：揮發(fā)油－β－環(huán)糊精為1∶6.8，包合時(shí)間2.2h，包合溫度46.95 ℃，在此條件下?lián)]發(fā)油的包合率可達(dá)82.23%?？紤]到試驗(yàn)操作的可行性，將包合工藝的最佳條件修正為：揮發(fā)油－β－環(huán)糊精為1∶6.8，包合時(shí)間2.2h，包合溫度47℃，在此條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)。

驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明，揮發(fā)油包合率基本穩(wěn)定，包合率的均值（82.11%）與包合率的預(yù)測(cè)值（82.23%）的相對(duì)誤差很小，證明包合工藝合理、可行。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)超聲法、飽和水溶液法2種包合方法進(jìn)行比較研究，確定飽和水溶液法為較好的包合方法。然后采用單因素實(shí)驗(yàn)初步優(yōu)化β－CD 加入量、包合時(shí)間、包合溫度對(duì)包合工藝的影響，再用Box－Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化揮發(fā)油的包合工藝，得出的最優(yōu)飽和水溶液包合工藝條件為：揮發(fā)油－β－環(huán)糊精為1∶6.8，包合時(shí)間2.2h，包合溫度47 ℃。揮發(fā)油的包合率為82.11%，包合率的均值（82.11%）與包合率的預(yù)測(cè)值（82.234%）的相對(duì)誤差很小，證明包合工藝合理、可行。

目前，國內(nèi)關(guān)于揮發(fā)油的包合工藝研究多采用正交設(shè)計(jì)、均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)，這些實(shí)驗(yàn)是建立在線性模型的基礎(chǔ)上，只能對(duì)一個(gè)個(gè)孤立的實(shí)驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)精確度不高，預(yù)測(cè)性較差；而效應(yīng)面法采用多元非線性擬合、二項(xiàng)式回歸分析，囊括了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、建模、檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷暮线m性、尋求最佳組合條件等眾多試驗(yàn)和統(tǒng)計(jì)技術(shù)，擬合預(yù)測(cè)能力優(yōu)異可靠，該方法應(yīng)用于揮發(fā)油包合工藝及中藥制備工藝的優(yōu)選，有較好的應(yīng)用前景。

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