張星，陸兔林，毛春芹，蔡寶昌，顧娟娟，弓曉東，胡俊揚(yáng)，吳楊 （.南京中醫(yī)藥大學(xué)江蘇省中藥炮制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京0046；.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京0046）

補(bǔ)陽(yáng)還五湯出自《醫(yī)林改錯(cuò)》下卷，由清代名醫(yī)王清任所創(chuàng)制［1］，由生黃芪、當(dāng)歸尾、赤芍、川芎、桃仁、地龍、紅花組成，具有補(bǔ)氣活血、化淤通絡(luò)之功效，主要用于治療半身不遂，遺尿不禁等氣虛血淤證，是臨床治療老年中風(fēng)癥常用經(jīng)驗(yàn)方劑。眾所周知，中藥的煎煮方法及煎藥器具直接影響中藥的質(zhì)量及療效。目前，市場(chǎng)上有關(guān)湯劑煎煮的器具種類繁多，比如砂鍋、搪瓷鍋、不銹鋼鍋等，甚至有人仍使用鋁鍋或鐵鍋煎煮中藥，致使藥物療效降低，因?yàn)殇X、鐵、銅的金屬活性較強(qiáng)，很可能與中藥中的某些成分起化學(xué)反應(yīng)，這種化學(xué)反應(yīng)可使藥物中的某些有效成分發(fā)生沉淀，生成對(duì)人體有害的物質(zhì)［2］。傳統(tǒng)煎藥一般通用的是有蓋的陶瓷砂鍋，還有部分人使用全自動(dòng)煎藥壺及不銹鋼鍋等。本實(shí)驗(yàn)以測(cè)定不同器具煎煮的補(bǔ)陽(yáng)還五湯中多成分含量評(píng)價(jià)各個(gè)煎煮器具的優(yōu)劣，優(yōu)選最佳的煎煮器具，為臨床湯劑煎煮規(guī)范提供可靠依據(jù)。

現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道該方的主要活性成分包括黃酮類、揮發(fā)油及多糖等［3］，其中以黃芪中的黃酮類成分含量較高，如毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素等，且黃酮類成分具有抗心肌缺血、抗炎、清除自由基等藥理作用［4］，桃仁中的苦杏仁苷具有活血祛淤之功［5－7］，赤芍中的芍藥苷有鎮(zhèn)靜、抗過敏、血管擴(kuò)張等藥理作用［8－10］。本文建立了用HPLC同時(shí)檢測(cè)補(bǔ)陽(yáng)還五湯中苦杏仁苷、芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素4種有效成分含量的方法［11－13］，并應(yīng)用該法評(píng)價(jià)優(yōu)選補(bǔ)陽(yáng)還五湯最佳煎煮器具，為補(bǔ)陽(yáng)還五湯臨床煎煮應(yīng)用提供了可靠依據(jù)，從而更加全面、有效的控制其質(zhì)量，保證其療效。

1 材料

Agilent 1100高效液相色譜儀；KQ－500B 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；FA1104型萬分之一電子分析天平（上海天平儀器廠）；HH－S型水浴鍋（鞏義市英峪予華儀器廠）；砂鍋（景德鎮(zhèn)嘉寶瓷業(yè)發(fā)展有限公司）；不銹鋼鍋（美的集團(tuán)有限公司）；全自動(dòng)中藥壺（廣東潮州奇巧貿(mào)易有限公司）。

苦杏仁苷對(duì)照品（批號(hào)820－200002）、芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)110736－201035）、芒柄花素對(duì)照品（批號(hào)111703－200501）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品（批號(hào)110796－201017，購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司，純度均大于99%）；補(bǔ)陽(yáng)還五湯的樣品和陰性樣品均自制；黃芪、當(dāng)歸、赤芍、紅花、川芎、桃仁、地龍均購(gòu)自江蘇海昌中藥飲片有限公司，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院陳建偉教授鑒定，符合中國(guó)藥典2010 年版一部相關(guān)規(guī)定，均為正品飲片；乙腈（美國(guó)Tedia公司）、甲醇（上海凌峰化學(xué)試劑公司）為色譜純，水為二次重蒸水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及系統(tǒng)試用性試驗(yàn) 采用依利特Hypersil ODS2色譜柱（250mm×4.6mm，5μm），乙腈（A）－0.1%磷酸水溶液（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫，具體梯度見表1，流速為1mL·min－1，檢測(cè)波長(zhǎng)為218nm，柱溫為30℃，進(jìn)樣量10μL，分析時(shí)間為80min。

表1 梯度洗脫順序Tab 1 Gradient elution of mobile phase

2.2 對(duì)照品溶液的制備 分別稱取苦杏仁苷、芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷及芒柄花素對(duì)照品適量，加甲醇配制成每1mL 分別含苦杏仁苷0.938 mg、芍藥苷0.977 mg、毛蕊異黃酮葡萄糖苷0.864 mg、芒柄花素0.44mg的單個(gè)組分對(duì)照品溶液。

分別精密量取上述單個(gè)組分對(duì)照品溶液至10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，配成每1mL 分別含苦杏仁苷0.187 6mg、芍藥苷0.195 4mg、毛蕊異黃酮葡萄糖苷0.172 8mg及芒柄花素0.088mg的混合對(duì)照品液。

2.3 供試品溶液的制備 分別取補(bǔ)陽(yáng)還五湯一劑處方量的飲片（黃芪120g，當(dāng)歸6g，赤芍5g，川芎、紅花、桃仁、地龍各3g）于砂鍋、不銹鋼鍋、全自動(dòng)中藥壺中加相當(dāng)于飲片10倍量的水，浸泡30min，砂鍋、不銹鋼鍋明火加熱煎煮30 min，全自動(dòng)中藥壺?zé)o明火加熱煎煮30min，各煎煮2次（2次加水比例6∶4），兩層紗布過濾，合并濾液，濃縮，定容至300 mL。實(shí)驗(yàn)平行操作5次。

精密量取補(bǔ)陽(yáng)還五湯濃縮液20mL，水浴蒸干，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25mL，密塞，稱定，超聲處理30 min，取出，放冷至室溫，稱定，加甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液，過0.45μm 的微孔濾膜。

2.4 陰性對(duì)照溶液的配制 按處方比例分別稱取除黃芪、赤芍、桃仁以外的其余藥味，按“2.3”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法操作制成缺黃芪、缺赤芍、缺桃仁的陰性對(duì)照溶液。

2.5 專屬性試驗(yàn) 分別取混合對(duì)照品溶液，供試品溶液及陰性對(duì)照溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣分析，液相色譜圖見圖1。陰性樣品在指標(biāo)成分苦杏仁苷、芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素的色譜峰位置上無吸收，表明該方法的專屬性良好。

圖1 補(bǔ)陽(yáng)還五湯的HPLC色譜圖A.混合對(duì)照品；B.補(bǔ)陽(yáng)還五湯樣品；C.陰性樣品；1－苦杏仁苷；2－芍藥苷；3－毛蕊異黃酮葡萄糖苷；4－芒柄花素Fig 1 HPLC chromatograms of Buyang Huanwu decoctionA.mixed reference substance；B.samples；C.negative sample；1－amygdalin；2－paeoniflorin；3－calycosin glucoside；4－Formononetin

2.6 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.2”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液0.2，0.5，1，2.5，5 mL 至5 mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，分別進(jìn)樣分析，進(jìn)樣量10 μL 記錄峰面積。以峰面積Y 對(duì)進(jìn)樣量X（mg·mL－1）進(jìn)行線性回歸，求得苦杏仁苷、芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷及芒柄花素的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍，結(jié)果見表2。

表2 4種有效成分的線性方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍Tab 2 Regression equation，correlation coefficient and linearity range of 4compounds

結(jié)果表明，苦杏仁苷、芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷及芒柄花素的含量分別在0.007 5～0.187 6 mg·mL－1、0.007 8～0.195 4mg·mL－1、0.006 9～0.172 8mg·mL－1、0.003 5～0.088 0mg·mL－1范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.7 精密度試驗(yàn) 取上述對(duì)照品溶液，在上述色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄苦杏仁苷、芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷及芒柄花素峰面積，并計(jì)算其RSD分別為0.95%，0.84%，1.09%，1.62%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密量取砂鍋煎煮的補(bǔ)陽(yáng)還五湯樣品1份，按照供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，分別在0，2，4，8，12，20h測(cè)定樣品中各組分的峰面積，計(jì)算苦杏仁苷、芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷及芒柄花素峰面積的RSD 分別為0.75%，1.34%，2.02%，1.78%，表明供試品溶液在20h內(nèi)穩(wěn)定。

表3 不同器具煎煮對(duì)補(bǔ)陽(yáng)還五湯4種成分的含量的影響（mg·g－1，n＝5）Tab 3 Influence of different boiling apparatus on the contents of the four ingredients of Buyang Huanwu decoction（n＝5）

2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 精密量取砂鍋煎煮的補(bǔ)陽(yáng)還五湯樣品6份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品液，進(jìn)樣10μL，記錄峰面積，并計(jì)算含量。結(jié)果樣品中苦杏仁苷、芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素平均含 量 分 別 為7.7869，4.503，0.4996，0.0782 mg·g－1，RSD 分別為0.62%，0.17%，0.62%，0.10%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.10 準(zhǔn)確度試驗(yàn) 精密量取砂鍋煎煮的補(bǔ)陽(yáng)還五湯樣品9份，每份10mL，置具塞錐形瓶中，水浴蒸干，根據(jù)樣品中苦杏仁苷、芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷及芒柄花素含有量的80%，100%，120%，分別加入混合對(duì)照品溶液（含苦杏仁苷0.667 4 mg·mL－1、芍藥苷0.349 8 mg·mL－1、毛蕊異黃酮葡萄糖 苷1.328 7 mg·mL－1、芒 柄 花 素0.126 5 mg·mL－1）0.8，1，1.2mL，各3份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果苦杏仁苷、芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素的平 均 回 收 率 分 別 為99.35%，98.75%，101.65%，101.63%，RSD 分 別 為0.21%，0.24%，1.03%，0.62%。

2.11 樣品含量測(cè)定 取3種不同器具煎煮的的補(bǔ)陽(yáng)還五湯共15份（每種平行5份），按“2.3”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測(cè)定含量，以一劑處方生藥總量計(jì)算，結(jié)果見表3。

由表3經(jīng)過t檢驗(yàn)可見，砂鍋煎煮組補(bǔ)陽(yáng)還五湯藥液中4種成分含量均與不銹鋼鍋組及全自動(dòng)中藥壺組有顯著性差異（P＜0.01），說明使用傳統(tǒng)砂鍋煎煮補(bǔ)陽(yáng)還五湯最佳；而不銹鋼煎煮組與全自動(dòng)中藥壺組差異也具有顯著性（P＜0.01），說明使用不銹鋼煎煮補(bǔ)陽(yáng)還五湯有效成分含量最低。

3 討論

補(bǔ)陽(yáng)還五湯成分復(fù)雜，其主要有效成分的紫外吸收差異很大，通過HPLC 在210，218，230，260，300nm 波長(zhǎng)下檢測(cè)，結(jié)果表明在218nm 處有被測(cè)各種成分均能出峰，260nm 以上芍藥苷被測(cè)靈敏度大大降低，苦杏仁苷基本檢測(cè)不出。為使各組分在同一波長(zhǎng)下都能有較好吸收，達(dá)到吸收強(qiáng)、干擾小的目的，故選擇218nm，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)4個(gè)成分的同時(shí)測(cè)定，以全面評(píng)價(jià)湯劑的質(zhì)量。

本文通過同時(shí)測(cè)定補(bǔ)陽(yáng)還五湯中4種有效成分的含量?jī)?yōu)選其最佳煎煮器具，得出砂鍋效果最好。造成如此結(jié)果的原因可能是砂鍋煎煮中藥是使用明火加熱，受熱均勻，升溫速度相對(duì)較慢，煎出藥液性質(zhì)穩(wěn)定且煎汁較濃，故有效成分含量較高；全自動(dòng)中藥壺雖然也是搪瓷制品，但是屬于無明火加熱，受熱不均；而使用不銹鋼鍋煎煮中藥，因?yàn)槭墙饘儋|(zhì)地，所以升溫速度過快，飲片受熱不均，煎汁色澤較淡且性質(zhì)不穩(wěn)，故所測(cè)有效成分含量最低。

本實(shí)驗(yàn)研究得出采用傳統(tǒng)砂鍋煎煮補(bǔ)陽(yáng)還五湯有效成分含量最高。煎煮器具對(duì)中藥湯劑質(zhì)量及療效的影響目前研究還屬于初步階段，本實(shí)驗(yàn)為其進(jìn)一步研究提供了可靠地理論依據(jù)，同時(shí)也為臨床湯劑煎煮技術(shù)的規(guī)范化提供了有力的科學(xué)參考。

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