賈曉寧 李家棟 邵正威 王巧云

(濱州醫(yī)學(xué)院口腔學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264000)

芒柄花素屬異黃酮類化合物。研究證明黃芪中的黃酮類成分有增強(qiáng)免疫、抗心肌缺血、保肝、抗炎、抗突變、清除自由基等藥理作用〔1〕，而芒柄花素也可以在一定程度上降低高脂血癥金黃地鼠血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)，升高高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)；改善肝脂肪化、減輕炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；抑制胸主動(dòng)脈壁內(nèi)膜下泡沫細(xì)胞形成和中膜平滑肌增生，具有抑制肝臟脂肪沉積和預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化的作用〔2～4〕。芒柄花素有植物雌激素的特征，在體內(nèi)具有雌激素樣作用，可用于更年期綜合征的防治〔5〕。但芒柄花素對(duì)胃腸平滑肌運(yùn)動(dòng)功能的影響報(bào)道很少。本實(shí)驗(yàn)通過離體家兔十二指腸平滑肌灌流方法，觀察不同濃度的芒柄花素對(duì)離體腸平滑肌收縮活動(dòng)的影響及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1藥品 芒柄花素(南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，純度為98%，批號(hào)ZL20091211)，實(shí)驗(yàn)時(shí)將芒柄花素用DMSO配成藥液備用。

1.2試劑 釕紅(RR)、Bay K8644、左旋硝基精氨酸甲酯(L-NAME)購(gòu)自Sigma公司；乙酰膽堿(Ach，批號(hào)091201，中科院上海生物化學(xué)研究所試劑廠)。磷酸組胺(中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所)。氯化鋇(BaCl2，自貢市張家壩鹽華有限公司)。實(shí)驗(yàn)用Tyrode′s 液(臺(tái)式液，g)：氯化鈉(NaCl) 8.0，氯化鈣(CaCl2) 0.2，氯化鉀(KCl) 0.2，氧化鎂(MgCl2) 0.1，NaHCO31.0，KH2PO40.05，葡萄糖1.0。無鈣Tyrode′s 液以EDTA代替CaCl2外，其余成分相同。

1.3動(dòng)物 家兔 (2.5±0.4)kg，雌雄兼用(由本院動(dòng)物中心提供)。

1.4儀器 BL-420F生物信號(hào)處理系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)，JH-2型肌張力傳感器(中國(guó)北京航天醫(yī)學(xué)工程研究所產(chǎn)品)。

1.5實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1家兔離體小腸平滑肌標(biāo)本的制備 取健康家兔，禁食24 h后，用木槌猛擊兔頭枕部致死。迅速沿腹正中線切開腹部，取近回盲部小腸20 cm。置于盛有室溫Tyrode′s液的燒杯中，洗凈腸內(nèi)容物。將其剪成2～3 cm的腸段作為實(shí)驗(yàn)標(biāo)本。

1.5.2收縮活動(dòng)的記錄方法 將標(biāo)本的一端固定于L形鉤上，置于盛有20 ml Tyrode′s液的平滑肌槽中；另一端連接張力換能器，持續(xù)通混合氣體(0.95±0.05)CO2，每秒1～2個(gè)氣泡，溫度(37±0.5)℃ ，張力負(fù)荷2 g，平衡1 h，待系統(tǒng)穩(wěn)定后，開始實(shí)驗(yàn)。

1.5.3芒柄花素對(duì)小腸平滑肌自主收縮活動(dòng)的影響 待回腸收縮曲線穩(wěn)定后，累計(jì)加入芒柄花素，使終濃度分別達(dá)10、20、40、60、80、100 μmol/L，加藥間隔時(shí)間為5 min，觀察芒柄花素對(duì)家兔小腸平滑肌自發(fā)收縮活動(dòng)的影響。用區(qū)間測(cè)量法測(cè)量給藥前1 min及給藥后第5分鐘的張力，以給藥前的值為100%，按公式計(jì)算給藥后小腸舒張百分率〔6〕。

1.5.4芒柄花素對(duì)Ach、BaCl2及HA所致腸痙攣性收縮的影響 待回腸收縮曲線穩(wěn)定后，首先給予Ach(0.1 μmol/L)、BaCl2(10 mg/L)或組胺(HA，5 mg/L)，當(dāng)刺激平滑肌收縮達(dá)平臺(tái)后，再累計(jì)加入芒柄花素(終濃度同上)，觀察其對(duì)Ach、BaCl2或HA刺激所致痙攣性收縮腸平滑肌是否具有舒張作用。

1.5.5芒柄花素對(duì)BayK8644、釕紅作用的影響 觀察芒柄花素60 μmol/L預(yù)孵育5 min后對(duì)Bay K8644(0.5 μmol/L)、釕紅(10 μmol/L)致小腸平滑肌自發(fā)收縮活動(dòng)的影響。對(duì)照組采用相等容積的DMSO。

1.5.6芒柄花素對(duì)L-NAME作用的影響 待離體腸平滑肌標(biāo)本收縮活動(dòng)穩(wěn)定后， L-NAME(100 μmol/L) 預(yù)孵育10 min后再加入芒柄花素60 μmol/L，觀察小腸平滑肌收縮活動(dòng)的變化。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件，組間差異比較采用單因素方差分析中的LSD方法。

2 結(jié) 果

2.1芒柄花素對(duì)家兔離體腸平滑肌收縮活動(dòng)的影響 10～100 μmol/L芒柄花素能夠劑量依賴性抑制小腸平滑肌自發(fā)性收縮，使舒張作用增強(qiáng)。對(duì)HA、Ach以及BaCl2所致腸平滑肌痙攣性收縮亦均有不同程度的抑制作用，但各劑量組作用均強(qiáng)于腸平滑肌自發(fā)性收縮(P<0.05或P<0.01)。芒柄花素濃度為100 μmol/L時(shí)，對(duì)HA痙攣性收縮的抑制率為85.29%；BaCl2次之，抑制率為81.88%；而對(duì)Ach引起痙攣性收縮抑制率為73.16%左右，與對(duì)HA痙攣性收縮的抑制作用比較，差異有顯著性(P<0.05)；但對(duì)腸平滑肌自發(fā)收縮活動(dòng)抑制作用較弱，僅為57.84%。見表1，圖1。

表1 芒柄花素對(duì)家兔離體腸平滑肌收縮活動(dòng)的影響

2.2芒柄花素對(duì)Bay K8644作用的影響 Bay K8644是L型鈣離子(Ca2+)通道開放劑，與對(duì)照組比較Bay K8644(0.5 μmol/L)使小腸平滑肌自發(fā)收縮張力由(1.03±0.03)g增加到(1.27±0.09)g(P<0.01)；而加入芒柄花素(60 μmol/L) 后再加入Bay K8644(0.5 μmol/L)收縮張力降為(0.64±0.1)g(P<0.01，與Bay K8644組比較)。

2.3芒柄花素對(duì)RR作用的影響 RR是肌漿網(wǎng)ryanodine受體阻斷劑，在臺(tái)式液中加入RR(10 μmol/L)，其抑制平滑肌細(xì)胞肌漿網(wǎng)釋放Ca2+，可使小腸平滑肌自發(fā)性收縮張力減弱，RR(10 μmol/L)使小腸平滑肌自發(fā)收縮張力由(1.02±0.05)g減小到(0.80±0.03)g(P<0.01)；而加入芒柄花素(60 μmol/L)后再加入RR收縮張力為(0.74±0.08)g，與DMSO+釕紅組比較無顯著性差異(P>0.05)。

2.4芒柄花素對(duì)L-NAME作用的影響 L-NAME是一氧化氮合酶抑制劑，L-NAME (100 μmol/L)使小腸平滑肌自發(fā)收縮張力由(1.01±0.05)g變?yōu)?0.96±0.09)g，無顯著影響(P>0.05)；單加入芒柄花素(60 μmol/L)后小腸平滑肌收縮張力降為(0.68±0.14)g，與L-NAME組比較有顯著差異(P<0.01)；L-NAME+芒柄花素組使小腸平滑肌收縮張力降為(0.73±0.05)g，與芒柄花素組比較無顯著性差異(P>0.05)，說明L-NAME不能夠抑制芒柄花素舒張平滑肌的作用。

a～f:10，20，40，60，80，100 μmol/L芒柄花素

3 討 論

目前研究認(rèn)為胃腸道上主要存在M膽堿受體、HA受體、5-HT受體及多種胃腸激素等受體。Ach是平滑肌內(nèi)興奮傳遞的化學(xué)物質(zhì)能，激動(dòng)M膽堿受體，M受體耦聯(lián)G蛋白(GP)，使胞內(nèi)第二信使三磷酸肌醇(IP3)和二?；视?DG)濃度上升，進(jìn)而引起 Ca2+釋放和底物蛋白磷酸化激發(fā)平滑肌產(chǎn)生收縮效應(yīng)。HA是具有多種生理功能的胺類物質(zhì)。目前已發(fā)現(xiàn)3種HA受體，其中能被傳統(tǒng)抗組胺藥所阻滯的豚鼠平滑肌上的組胺受體被稱為H1型組胺受體(H1-R)， HA作用于H1-R使鈣通道開放，胞內(nèi)游離Ca2+濃度升高，促發(fā)胃腸道平滑肌收縮〔7〕。而BaCl2是通過釋放細(xì)胞內(nèi)的Ca2+而引起腸管平滑肌痙攣〔8〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，芒柄花素能劑量依賴性地抑制腸平滑肌的自發(fā)性收縮，為進(jìn)一步觀察其收縮作用的受體機(jī)制，以Ach、HA或BaCl2引起腸平滑肌痙攣性收縮，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，芒柄花素對(duì)痙攣收縮的腸管平滑肌亦具有不同程度的舒張，但對(duì)痙攣收縮腸平滑肌的作用明顯強(qiáng)于自發(fā)性收縮腸平滑肌。

因Ach、HA以及BaCl2引起腸管平滑肌痙攣性收縮，都與腸平滑肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+增多有關(guān)。故認(rèn)為芒柄花素抑制三者引起的腸平滑肌收縮作用與降低細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度有關(guān)。腸道平滑肌收縮所需的大部分Ca2+是在動(dòng)作電位發(fā)生時(shí)從細(xì)胞外進(jìn)入肌細(xì)胞內(nèi)的，小部分來源于肌質(zhì)網(wǎng)，當(dāng)胞內(nèi)Ca2+濃度升高到一定水平時(shí)，觸發(fā)平滑肌收縮〔9〕。為進(jìn)一步研究芒柄花素對(duì)外鈣內(nèi)流和內(nèi)鈣釋放的作用，本實(shí)驗(yàn)觀察了在芒柄花素預(yù)處理下L型鈣通道(L-Ca2+)的開放劑Bay K8644以及肌漿網(wǎng)ryanodine受體阻斷劑釕紅對(duì)胃腸平滑肌活動(dòng)影響的變化。

腸平滑肌中主要的鈣通道是L-Ca2+，實(shí)驗(yàn)中給予小腸平滑肌L型鈣通道的開放劑Bay K8644，大量的鈣離子通過L-Ca2+進(jìn)入平滑肌細(xì)胞內(nèi)，使其自發(fā)收縮力提高。而給予芒柄花素后，這種效應(yīng)被明顯抑制，由此可以推斷芒柄花素可能阻斷了L-Ca2+，抑制Bay K8644引起的外鈣內(nèi)流，從而抑制小腸平滑肌的收縮。肌漿網(wǎng)ryanodine受體阻斷劑釕紅能夠抑制肌漿網(wǎng)釋放鈣離子，使細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度降低，小腸平滑肌自發(fā)收縮張力降低，而以芒柄花素預(yù)孵育后給予釕紅，其舒張腸平滑肌作用被抑制，由此推斷芒柄花素可能對(duì)肌漿網(wǎng)ryanodine受體亦發(fā)揮阻斷作用，從而抑制內(nèi)鈣釋放。

有研究表明〔10〕，NO通過激活平滑肌細(xì)胞內(nèi)的鳥苷酸環(huán)化酶，使胞質(zhì)cGMP濃度升高，胞內(nèi)Ca2+降低，導(dǎo)致平滑肌舒張。本實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用NO合酶抑制劑L-NAME，可以降低組織中NO的濃度，但對(duì)腸平滑肌張力無明顯影響，與文獻(xiàn)報(bào)道一致〔11〕。L-NAME預(yù)孵育不能抑制芒柄花素舒張腸平滑肌作用，說明芒柄花素對(duì)小腸平滑肌的抑制作用可能與NO濃度無關(guān)，但對(duì)鳥苷酸環(huán)化酶有無影響尚待進(jìn)一步研究。

綜上，芒柄花素明顯抑制了家兔離體小腸平滑肌的收縮活動(dòng)，抑制外Ca2+內(nèi)流和內(nèi)Ca2+釋放是其機(jī)制之一，與腸平滑肌NO濃度無關(guān)。

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