王春敏 佟麗波 韓桂華 任繼秋 崔 剛

(佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物教研室，黑龍江 佳木斯 154007)

動物胃腸道內(nèi)數(shù)量和種類多樣的微生物與動物的健康和疾病密切相關(guān)，已漸漸引起重視并成為研究熱點〔1，2〕。傳統(tǒng)的腸道菌群分析多采用活菌計數(shù)法，迄今為止，腸道中只有極少部分微生物可以被培養(yǎng)。對于用傳統(tǒng)方法難以分離培養(yǎng)的細(xì)菌或目前尚未了解的細(xì)菌來說，傳統(tǒng)方法往往難以作出全面的分析。16S rDNA在細(xì)菌中普遍存在，其可變區(qū)和保守區(qū)交錯排列，可用于細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育分析?；?6S rDNA的變性梯度凝膠電泳(DGGE)技術(shù)，理論上可以檢測DNA片段中的一個堿基變化，在揭示自然界微生物群落遺傳多樣性和種群差異方面具有獨特的優(yōu)越性〔3〕。本實驗采用PCR-DGGE技術(shù)研究不同抗生素對小鼠腸道微生物變化的影響，以探討不同抗生素對小鼠腸道菌群多樣性的影響及機制。

1 材料與方法

1.1主要試劑 QIAamp DNA Stool Mini Kit購于上海東盛創(chuàng)新實驗技術(shù)有限公司；PCR試劑盒(dNTPs、Buffer、MgCl2、Taq酶)大連寶生物生物有限公司；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺尿素、去離子甲酰胺、瓊脂糖、溴乙啶購于北京博大泰克生物科技有限公司。16 SrDNA V3可變區(qū)擴增通用引物：357f(5′-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACG GGAGGCAGCAG-3′)和518r (5′-ATTACCGCGGCTGCTCC-3′)，委托上海生工生物工程公司合成。

1.2實驗動物及處理 昆明純系小鼠30只，雌雄各半，體重(20±2)g購于佳木斯大學(xué)實驗動物中心。隨機分為對照組(A組)、鹽酸林可霉素組(B組)和硫酸慶大霉素組(C組)。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 d后，B組灌鹽酸林可霉素80 mg·kg-1·d-1，C組灌胃硫酸慶大霉素20 mg·kg-1·d-1，A組灌胃等量生理鹽水。2次/d，間隔6 h，連續(xù)灌胃5 d。

1.3小鼠糞便腸道菌群總DNA提取及PCR擴增 小鼠灌胃5 d后無菌取各組小鼠糞便樣品0.2 g，嚴(yán)格按試劑盒說明操作，提取腸道菌群總DNA，提取的DNA通過1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性，并用核酸定量儀測定其DNA含量，置-20℃保存?zhèn)溆?。以提取的基因組總DNA為模板，使用16 SrDNA V3可變區(qū)通用擴增引物對其進(jìn)行擴增。PCR的反應(yīng)體系(50 μl)組成為DNA模板2 μl，引物各1 μl，10倍緩沖液(含Mg2+)5 μl，dNTP 2 μl，Taq酶 0.25 μl，加去離子水補至50 μl。擴增程序為94℃ 5 min，(94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s)30個循環(huán)，72℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠上電泳，溴乙啶染色，紫外光下觀察擴增效果。

1.4DGGE分析 采用 Bio-Rad Dcode 進(jìn)行 DGGE 凝膠電泳。變性劑線性梯度范圍為35%～65%，1×TAE緩沖液，先在220 V條件下預(yù)電泳10 min，隨后在150 V條件下電泳8 h，電泳結(jié)束后 ，硝酸銀染色〔4〕，用 TANON-2500凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，觀察DNA條帶并記錄重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

應(yīng)用DGGE技術(shù)分離16S rDNA V3區(qū)段PCR產(chǎn)物，三組糞便樣品經(jīng)DGGE后都分離出數(shù)目不等的電泳條帶，可分辨的條帶5～12條，而且不同組標(biāo)本之間帶型存在差異。B、C兩組與A相比較，電泳條帶減少尤以B組電泳條帶最少，且B、C兩組之間還存在差異。見圖1。

圖1 各組細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)段PCR產(chǎn)物

3 討 論

DGGE技術(shù)是由Fischer和Lerman最先提出并應(yīng)用于檢測基因突變的技術(shù)〔5〕。Muyzer等〔6〕將其引入微生物分子生態(tài)學(xué)研究中。該技術(shù)打破部分細(xì)菌不可培養(yǎng)性的局限，不僅可以比較不同樣品中細(xì)菌的多樣性和相似性，而且還可以通過對目標(biāo)帶的回收、克隆和測序進(jìn)一步分析特征性的細(xì)菌種群?，F(xiàn)PCR-DGGE技術(shù)已用于多種生態(tài)環(huán)境微生物菌群研究。其中包括消化道及糞便菌群研究〔7～9〕。DGGE圖譜中可區(qū)分出很多清晰的條帶，每一條帶代表某個微生物菌群。每一條帶的密度反映細(xì)菌的相對構(gòu)成比例。

本實驗采用該技術(shù)檢測兩種抗生素應(yīng)用前后小鼠腸道細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)段PCR擴增產(chǎn)物，從而了解抗生素應(yīng)用對小鼠腸道菌群的影響。本實驗結(jié)果體現(xiàn)出腸道微生態(tài)發(fā)生較大變化，且不同抗生素對腸道微生態(tài)的影響不一致。分析其原因：鹽酸林可霉素抗菌譜主要針對革蘭陽性菌(包括革蘭陽性厭氧菌)，慶大霉素抗菌譜主要針對革蘭陰性菌，所以兩種抗生素分別作用于小鼠腸道后，小鼠腸道內(nèi)優(yōu)勢菌群的種類和數(shù)量必發(fā)生不同變化，反映在DGGE圖譜中表現(xiàn)為條帶出現(xiàn)位置、多少及密度的不同。

綜上，采用PCR-DGGE技術(shù)可分析腸道菌群多樣性，并從分子水平證實抗生素可影響小鼠的腸道菌群結(jié)構(gòu)和多樣性。但不同抗生素對哪些優(yōu)勢菌群影響最大還需結(jié)合對目標(biāo)帶的回收、克隆和測序等手段明確。

4 參考文獻(xiàn)

1吳仲文,李蘭鵑,馬偉杭，等.腸道菌群正常參考值的檢測〔J〕.中國微生態(tài)學(xué)雜志,2001；13:314-5.

2徐凱進(jìn)，李蘭鵑.腸道正常菌群與腸道免疫〔J〕.國外醫(yī)學(xué)·流行病學(xué)傳染病學(xué)分冊，2005；32(3)：181-3.

3張寶濤.PCR-DGGE技術(shù)及其在微生物生態(tài)學(xué)中的應(yīng)用〔J〕.生物信息學(xué)，2006；4(3):132-42.

4Sanguninetti CJ，Dias Neto E,Simpson AJ.Rapid silver staining and recovery of PCR products separated on polyacylamide gels〔J〕.Biotechniques，1994；17(5):914-21.

5Fisher SG,Lerman LS.DNA fragments differing by single base-pair substitutions are separated in denaturing gradient gels:correspondence with melting theory〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,1983；80(6):1579-83.

6Muyzer G,de Waal EC，Uitterlinden AG.Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rRNA〔J〕.Appl Environ Microbiol,1993；59(3):695-700.

7季天榮，陳 莊.DGGE技術(shù)優(yōu)化及其在腸道微生態(tài)研究中的應(yīng)用〔J〕.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008；(6)：93-6.

8Tannock GW,Munro K，Harmsen HJM,etal.Analysis of the fecal microflora of human subjects consuming a probiotic product containing Lactobacillus rhamnosus DR20〔J〕.Appl Environ Microbriol,2000；66:2578-88.

9于 濤，德力夏提·依米提，買買提·牙森，等.新疆維吾爾族長壽老人腸道菌群多樣性分析〔J〕.中國病原生物學(xué)雜志，2009；4(4)：271-4.