黃莉莉, 張智勤, 黃 琦, 蘇瑞蓮, 黃秀敏, 2

(1. 廈門大學附屬中山醫(yī)院 婦產(chǎn)科, 福建 廈門, 361004; 2. 福建醫(yī)科大學 臨床醫(yī)學部, 福建 福州, 350000)

宮頸癌是威脅女性健康的惡性腫瘤之一,目前臨床常采用手術(shù)、放化療等方式進行治療,由于部分患者對放化療藥物具有抵抗性,治療效果降低[1-2]。從植物中提取的活性成分具有抗腫瘤作用,研究[3-4]表明部分中藥具有抗腫瘤作用。毛蕊異黃酮屬于中藥黃芪的有效活性成分,具有抗病毒、抗腫瘤等作用。研究[5]表明,毛蕊異黃酮可抑制膀胱癌細胞增殖及促進細胞凋亡。但毛蕊異黃酮與宮頸癌相關(guān)研究報道相對較少。微小RNA(miRNA)在腫瘤等多種疾病中表達異常,可以通過調(diào)節(jié)癌癥細胞的凋亡和增殖從而調(diào)節(jié)癌癥的生長。研究[6-8]表明,miR-4766-5p在多種癌癥中低表達,包括胃癌、食管癌、結(jié)直腸癌等,且作為抑癌基因參與調(diào)節(jié)癌癥的發(fā)展。但miR-4766-5p對宮頸癌細胞增殖及凋亡的影響尚未可知。因此,本研究主要探討毛蕊異黃酮對宮頸癌細胞增殖及凋亡的影響,以及miR-4766-5p是否介導其作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選取2020年1—3月在廈門大學附屬中山醫(yī)院治療的宮頸癌患者49例為研究對象,患者平均年齡為(56.32±3.49)歲。手術(shù)時收集癌組織及癌旁組織,隨后置于-80 ℃保存。所有受試者均簽署知情同意書,本研究符合《世界醫(yī)學協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

毛蕊異黃酮購自上海源葉生物科技有限公司(純度≥98%); 人宮頸癌細胞HeLa由上海弘順生物科技有限公司提供; 上海碧云天生物公司提供DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、CCK-8試劑以及細胞凋亡檢測試劑盒。北京索萊寶提供 Lipofectamine2000; 反轉(zhuǎn)錄與PCR試劑由北京天根生化提供; miR-NC、miR-4766-5p mimics、anti-miR-4766-5p、anti-miR-NC由上海吉瑪合成; 美國Cell Signaling Technology公司提供兔抗人cleaved-caspase3、cleaved-caspase9抗體與HRP標記的二抗。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組: HeLa細胞接種于6孔板(1×105個/孔),分別與低、中、高濃度的(25、50、100 μmol/L)毛蕊異黃酮共培養(yǎng)24 h[7], 并設(shè)為毛蕊異黃酮-低組、毛蕊異黃酮-中組、毛蕊異黃酮-高組,未處理的細胞為對照組。用不含血清的培養(yǎng)基稀釋Lipofectamine2000, 不含血清的培養(yǎng)基分別稀釋miR-NC、miR-4766-5p mimics、anti-miR-NC、anti-miR-4766-5p, 培養(yǎng)6 h后將培養(yǎng)基更換為含有100%胎牛血清的正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法進行轉(zhuǎn)染,根據(jù)實驗計劃,部分細胞轉(zhuǎn)染后,經(jīng)100 μmol/L毛蕊異黃酮培養(yǎng)24 h, 細胞分別記為miR-NC組、miR-4766-5p組、毛蕊異黃酮+anti-miR-NC組以及毛蕊異黃酮+anti-miR-4766-5p組。

1.2.2 CCK-8實驗: 細胞轉(zhuǎn)染48 h后,收集各組HeLa細胞接種于96孔板(3×103個/孔)孵育一夜,隨后與10 μL CCK-8溶液共孵育2 h。 最后,在450 nm波長處檢測光密度(OD)值,并計算細胞增殖抑制率。

1.2.3 平板克隆形成實驗: 將HeLa細胞以每孔500個的密度接種于6孔板上。允許菌落生長10～14 d。棄掉培養(yǎng)基,磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次后,甲醇固定15 min, 隨后結(jié)晶紫染色20 min, 最后計數(shù)陽性菌落的形成(>50個/菌落)。

1.2.4 流式細胞術(shù): 收集各組HeLa細胞, PBS洗滌2次,并重懸于1 X Annexin V結(jié)合緩沖液中(5×105個/mL), 隨后分別與5 μL Annexin V-FITC與5 μL PI避光染色15 min, 于1 h內(nèi)使用流式細胞儀分析細胞凋亡。

1.2.5 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR): 采用Trizol試劑提取總RNA, 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。隨后以cDNA為模板,使用SYBR Green試劑盒或者Mir-X miRNA qRT-PCR TB Green? Kit進行qRT-PCR擴增。反應(yīng)條件: 95 ℃預(yù)變性2 min, 95 ℃變性30 s, 59 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s, 共40次循環(huán)。以U6為內(nèi)參,反應(yīng)結(jié)束后收集目的基因和內(nèi)參的Ct值,通過2-△△Ct法計算miR-4766-5p 含量。

1.2.6 蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot): 各組HeLa細胞與500 μL RIPA裂解液共孵育提取總蛋白,用8%～10% 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分解細胞總裂解物(大約40 μg), 轉(zhuǎn)膜后用5%牛血清白蛋白封閉2 h。隨后加入1∶1 000稀釋的cleaved-caspase3(Cat#9664)、cleaved-caspase9 (Cat#20750)與1∶2 000稀釋的GAPDH(Cat#92310)一抗, 4 ℃孵育過夜。TBST洗滌后與1∶3 000稀釋的二抗室溫孵育2 h。應(yīng)用Quantity One軟件對蛋白條帶進行定量。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié) 果

2.1 毛蕊異黃酮抑制HeLa細胞增殖

相較于未經(jīng)毛蕊異黃酮處理的細胞,毛蕊異黃酮-低組、毛蕊異黃酮-中組、毛蕊異黃酮-高組中的HeLa細胞增殖抑制率上升,細胞克隆形成能力受抑制,且呈劑量依賴性,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05), 見表1。

表1 毛蕊異黃酮對宮頸癌HeLa細胞增殖的影響

2.2 毛蕊異黃酮促進HeLa細胞凋亡

相較于未經(jīng)毛蕊異黃酮處理的細胞, HeLa細胞凋亡率以及cleaved-caspase3和cleaved-caspase9蛋白含量在毛蕊異黃酮-低組、毛蕊異黃酮-中組、毛蕊異黃酮-高組中上升,且呈劑量依賴性,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05), 見圖1、表2。

A: 凋亡相關(guān)蛋白表達; B: 細胞凋亡流式圖。圖1 毛蕊異黃酮對宮頸癌HeLa細胞凋亡的影響

表2 毛蕊異黃酮對宮頸癌HeLa細胞凋亡的影響

2.3 宮頸癌組織中miR-4766-5p的表達

癌旁組織中miR-4766-5p表達量為(1.00±0.11), 宮頸癌組織中miR-4766-5p的表達量為(0.40±0.04)。宮頸癌組織中miR-4766-5p的表達量低于癌旁組織,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.4 毛蕊異黃酮對宮頸癌HeLa細胞miR-4766-5p表達的影響

與對照組比較,毛蕊異黃酮-低組、毛蕊異黃酮-中組、毛蕊異黃酮-高組miR-4766-5p的表達量升高,且呈劑量依賴性,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05), 見表3。

表3 毛蕊異黃酮對宮頸癌HeLa細胞miR-4766-5p表達的影響

2.5 過表達miR-4766-5p促進HeLa細胞凋亡并抑制其增殖

相較于miR-NC組, miR-4766-5p組細胞增殖抑制率、凋亡率和cleaved-caspase3、cleaved-caspase9蛋白水平升高,克隆形成能力受到抑制,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05), 見圖2、表4。

A: 凋亡相關(guān)蛋白表達; B: 細胞凋亡流式圖。圖2 miR-4766-5p過表達對宮頸癌HeLa細胞凋亡的影響

表4 miR-4766-5p過表達對宮頸癌HeLa細胞增殖和凋亡的影響

2.6 干擾miR-4766-5p表達逆轉(zhuǎn)了毛蕊異黃酮(100 μmol/L)對宮頸癌HeLa細胞的作用

相較于毛蕊異黃酮+anti-miR-NC組,毛蕊異黃酮+anti-miR-4766-5p組增殖抑制率、細胞凋亡率和cleaved-caspase3、cleaved-caspase9蛋白水平降低,細胞克隆形成能力增高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05), 見圖3、表5。

A: 凋亡相關(guān)蛋白表達; B: 細胞凋亡流式圖。

表5 干擾miR-4766-5p表達逆轉(zhuǎn)了毛蕊異黃酮(100 μmol/L)對宮頸癌HeLa細胞增殖和凋亡的作用

3 討 論

中醫(yī)藥可通過調(diào)控多種基因或信號通路而發(fā)揮抗宮頸癌的作用[9-11]。miRNA可通過靶向調(diào)控靶基因表達影響宮頸癌細胞生物學行為[12-13]。但miRNA是否介導中醫(yī)藥在宮頸癌中的治療作用尚未可知。

毛蕊異黃酮是一種異黃酮類化合物,研究[14]表明,毛蕊異黃酮可抑制人黑色素瘤細胞增殖、遷移及侵襲。毛蕊異黃酮可通過抑制CyclinD1、基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP2)表達,進而破壞肺癌細胞的轉(zhuǎn)移及增殖[15]。在乳腺癌中,毛蕊異黃酮通過抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過程抑制癌細胞侵襲和遷移能力,還可抑制乳腺癌的生長[16-17]。毛蕊異黃酮可通過刺激氧化應(yīng)激促進胃癌細胞凋亡,從而發(fā)揮抗癌癥作用[18]。本研究中,毛蕊異黃酮能夠顯著抑制細胞增殖,刺激細胞凋亡,且呈劑量依賴性。此外, cleaved-caspase3和cleaved-caspase9的蛋白表達在宮頸癌細胞中隨著毛蕊異黃酮濃度的升高而上調(diào)。Caspase負責細胞凋亡過程中的大部分蛋白質(zhì)水解, cleaved-caspase3是檢測細胞凋亡的可靠標志; caspase-9通過與凋亡蛋白酶激活因子-1結(jié)合而被激活,隨后切割并激活下游Caspase-3和Caspase-7, 誘導caspase級聯(lián)和細胞死亡程序,同時caspase-9伴隨著自催化切割,在凋亡發(fā)生時cleaved-caspase9含量升高[19-20], 進一步提示毛蕊異黃酮促進宮頸癌細胞凋亡。

研究[7]證實, miR-4766-5p在多種癌癥中發(fā)揮抑癌作用。例如, miR-4766-5p在胃癌組織和細胞中低表達,上調(diào)其表達可破壞癌細胞的增殖、遷移和侵襲。研究[21]表明, miR-4766-5p過表達可抑制胃癌細胞增殖。miR-4766-5p過表達可抑制食管癌進展[8]。同時, miR-4766-5p被發(fā)現(xiàn)可以減弱結(jié)直腸癌細胞的轉(zhuǎn)移和增殖,該作用可能與circ_0000467/miR-4766-5p/KLF12通路有關(guān)[22]。因此,本研究推測miR-4766-5p在宮頸癌中也發(fā)揮抑癌作用。本研究結(jié)果顯示, miR-4766-5p在宮頸癌組織和細胞中低表達,而在宮頸癌細胞中經(jīng)毛蕊異黃酮處理后顯著上調(diào),提示miR-4766-5p可能參與毛蕊異黃酮的抗癌作用。隨后本研究證實,在宮頸癌細胞中過表達miR-4766-5p, 癌細胞增殖受到抑制。進一步實驗發(fā)現(xiàn),干擾miR-4766-5p表達可減弱毛蕊異黃酮對宮頸癌細胞增殖的抑制作用,以及對細胞凋亡的促進作用,表明毛蕊異黃酮可通過促進miR-4766-5p表達,進而抑制宮頸癌發(fā)展進程。

綜上所述,毛蕊異黃酮可通過上調(diào)miR-4766-5p表達,抑制宮頸癌細胞增殖,誘導細胞凋亡。毛蕊異黃酮或可作為治療宮頸癌的藥物,但其藥效仍需進一步臨床試驗驗證。本研究為毛蕊異黃酮聯(lián)合miR-4766-5p靶向治療宮頸癌提供了新的方向。