何芳，孔祥虹，，何強(qiáng)，高軍剛

（1.陜西師范大學(xué)，西安 710061；2.陜西出入境檢驗(yàn)檢疫局，西安 710068）

陜南地處秦巴山區(qū)之間，水資源豐富，地理?xiàng)l件復(fù)雜，具有生產(chǎn)和發(fā)展中藥材得天獨(dú)厚的條件和豐富的資源，素有“生物基因庫”和“天然藥庫”之稱，是全國(guó)中藥材的傳統(tǒng)產(chǎn)地和集散地之一。

中藥材在生長(zhǎng)和儲(chǔ)存過程中容易受到病蟲害的影響，大多使用化學(xué)農(nóng)藥進(jìn)行防治，因此在中藥材中會(huì)存在農(nóng)藥殘留問題［1-3］。中藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)不僅包括有效成分，還包括一些外源性的污染物［4］，如農(nóng)藥、重金屬、微生物等，其中農(nóng)藥殘留問題引起世界各國(guó)的高度重視。

目前有關(guān)中藥材中農(nóng)藥殘留分析的方法主要有氣相色譜法（GC）［4］、氣相色譜-質(zhì)譜法（GCMS）［5］、高效液相色譜法（HPLC）［6］、高效液相色譜法-質(zhì)譜法（HPLC-MS）［7-8］等。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀由于具有較高的靈敏度和較強(qiáng)的定性能力，成為目前農(nóng)藥多殘留同時(shí)檢測(cè)的主流分析儀器，可以實(shí)現(xiàn)數(shù)百種農(nóng)藥同時(shí)檢測(cè)［9-10］。中藥材基質(zhì)復(fù)雜，在進(jìn)行農(nóng)藥殘留分析時(shí)通常需要對(duì)樣品提取液進(jìn)行凈化。農(nóng)藥殘留的凈化技術(shù)主要有液-液萃??；固相萃取和凝膠滲透色譜（GPC）等方法。凝膠滲透色譜（GPC）作為一種新型的樣品凈化技術(shù)，已經(jīng)成功地應(yīng)用于各類樣品中農(nóng)藥的多殘留分析，但應(yīng)用于中藥材中農(nóng)藥多殘留的分析較少。筆者采用GPC或GPC-SPE凈化樣品，氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）作為檢測(cè)儀器，建立了GC-MS同時(shí)測(cè)定陜南中藥材中81種農(nóng)藥殘留的檢測(cè)方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

氣相色譜-質(zhì)譜儀：7890A／5975C型，美國(guó)Agilent公司；

凝膠滲透色譜凈化系統(tǒng)：GPC ultra 10836型，德國(guó)LCTech公司；

超純水制備儀：Mill-Q型，美國(guó)Millipore公司；

乙二胺-N-丙基甲硅烷（PSA）固相萃取小柱：300 mg／3 mL，使用前用5 mL乙腈活化并保持柱體濕潤(rùn)，美國(guó)Agilent公司；

乙腈、環(huán)己烷、乙酸乙酯、丙酮和正己烷：色譜純，美國(guó)TEDIA公司；

氯化鈉和無水硫酸鈉：分析純，美國(guó)Sigma公司；

81種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品：包括有機(jī)磷類、有機(jī)氯類、氨基甲酸酯類農(nóng)藥，純度不小于97℅，美國(guó)Sigma公司；

中藥材均購(gòu)自陜南地區(qū)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取適量各種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品，用含0.1%乙酸的乙腈溶解，配制成濃度為1 000 μg／mL的單標(biāo)儲(chǔ)備液，貯存于4℃冰箱中備用。

分別準(zhǔn)確移取上述81種農(nóng)藥化合物單標(biāo)儲(chǔ)備液500 μL于50 mL容量瓶中，用含0.1%乙酸的乙腈定容，配制成濃度均為10 μg／mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。用含0.1%乙酸的乙腈逐級(jí)稀釋得到1.0，0.1，0.05，0.02，0.01 μg／mL的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，貯存于4℃冰箱中備用。

1.3 樣品前處理

1.3.1 樣品提取

取中藥材樣品自然陰干，用高速粉碎機(jī)粉碎，過250 μm（60目）篩，稱取6 g（精確至0.01 g）樣品至50 mL聚丙烯離心管中，加入6 g NaCl，25 mL超純水混勻，超聲浸泡30 min。加入15 mL含0.1%乙酸的乙腈，振蕩20 min，以4 500 r／min離心6 min，取10 mL上清液至50 mL雞心瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，氮?dú)獯蹈?，用乙酸乙?環(huán)己烷（體積比為1∶1）10 mL溶解殘?jiān)?，過濾紙至GPC進(jìn)樣瓶中，待凈化。

1.3.2 樣品凈化

對(duì)于天麻樣品采用凈化法1——凝膠滲透色譜（GPC）凈化；杜仲、金銀花、山茱萸等樣品采用凈化法2——GPC-SPE固相萃取進(jìn)行凈化。

（1）凈化法1（天麻）GPC凈化條件。凝膠柱：內(nèi)徑25 mm，柱長(zhǎng)400 mm，填料為Bio-Beads-S-X3 Beads（38～74 μm）或相當(dāng)者；流動(dòng)相：乙酸乙酯-環(huán)己烷（體積比為1∶1）；流速：5.0 mL／min；進(jìn)樣量：5 mL；收集時(shí)間：900～1 900 s；在線濃縮至2 mL，氮?dú)獯抵两桑? mL乙腈溶解定容，待檢測(cè)。

（2）凈化法2 （杜仲、金銀花、山茱萸）。提取液經(jīng)GPC凈化，GPC凈化參數(shù)同1.3.2（1），將900～1 900 s經(jīng)GPC凈化后的流出液氮?dú)獯蹈?，然后進(jìn)行SPE凈化過程，5 mL乙腈洗滌濃縮瓶，洗滌液合并上樣，10 mL乙腈洗脫，收集全部流出液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，氮?dú)獯蹈桑?.0 mL乙腈溶解定容，待檢測(cè)。

1.4 氣相色譜-質(zhì)譜分析條件

1.4.1 氣相色譜條件

色譜柱：HP-5MS （30 m×0.25 mm，0.25 μm，美國(guó)Agilent公司）；載氣：氦氣（純度不小于99.999%），流量1.0 mL／min；進(jìn)樣量1.0 μL，不分流進(jìn)樣（1 min后開啟）；進(jìn)樣口溫度：250℃；程序升溫：初始溫度60℃，保持2 min，以15℃／min升到150℃，再以3℃／min升到180℃，保持2 min，以5℃／min升到280℃，保持3 min；質(zhì)譜連接口溫度：280℃。

1.4.2 質(zhì)譜條件

電子轟擊離子源：EI；電離能：70 eV；離子源溫度：230℃；四極桿溫度：150℃；掃描模式：選擇離子監(jiān)測(cè)（SIM）。

81種農(nóng)藥測(cè)定參數(shù)見表1。

表1 81種農(nóng)藥名稱、保留時(shí)間、質(zhì)譜參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 提取條件

2.1.1 提取方式

中藥材中農(nóng)藥殘留的提取方法主要有超聲波提取法和加速溶劑萃取法，由于加速溶劑萃取法需要專門的儀器設(shè)備，而超聲波提取法對(duì)實(shí)驗(yàn)條件要求較低，便于應(yīng)用，故本實(shí)驗(yàn)采用超聲波提取法對(duì)中藥材中的農(nóng)藥殘留進(jìn)行提取。

2.1.2 提取溶劑

分別考察乙腈、乙酸乙酯、丙酮、二氯甲烷作為提取溶劑對(duì)中藥材中農(nóng)藥殘留的提取效果。稱取4份6.00 g中藥材平行樣品，加入25 mL超純水，超聲浸泡30 min后分別加入15 mL乙腈、乙酸乙酯、丙酮、二氯甲烷，振蕩提取20 min，由于乙腈與水互溶，加入過飽和的氯化鈉溶液，利用鹽析作用使水相和有機(jī)相分離，以除去水和水溶性雜質(zhì)，同時(shí)還可減少提取液中的雜質(zhì)含量并提高待測(cè)組分在有機(jī)相中的分配比。結(jié)果表明，乙酸乙酯和丙酮對(duì)絕大多數(shù)農(nóng)藥有較大的溶解度，易將農(nóng)藥提取出來，但同時(shí)大量雜質(zhì)也被提取出來，給凈化帶來困難；二氯甲烷對(duì)部分農(nóng)藥的提取回收率只有20%左右；乙腈回收率高，提取液雜質(zhì)含量少，故采用乙腈作為提取溶劑。由于部分農(nóng)藥在弱酸性條件下性質(zhì)穩(wěn)定，因此采用含0.1%乙酸的乙腈進(jìn)行提取。

最終確定的提取方法：6.00 g樣品加25 mL超純水，超聲浸泡30 min后加入15 mL含0.1%乙酸的乙腈，振蕩提取20 min。

2.2 凈化條件

參考凝膠滲透色譜在甘草及其提取物中農(nóng)藥殘留凈化方法中的應(yīng)用，對(duì)天麻、杜仲、金銀花、山茱萸進(jìn)行GPC凈化實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：天麻回收率為78.5%～120.8%，而杜仲、金銀花、山茱萸可能存在基質(zhì)抑制效應(yīng)而回收率偏低。GPC主要去除糖、色素、油脂等大分子，杜仲、金銀花、山茱萸經(jīng)過GPC凈化后還存在一些小分子雜質(zhì)（有機(jī)酸和甾醇等），產(chǎn)生基質(zhì)抑制效應(yīng)，需要進(jìn)行進(jìn)一步凈化，參考相關(guān)文獻(xiàn)，選取PSA固相萃取小柱進(jìn)行進(jìn)一步的凈化，經(jīng)過GPC凈化的收集液，使用氮?dú)獯蹈桑? mL乙腈溶解上樣，5 mL乙腈洗滌濃縮瓶，洗滌液合并上樣，5 mL乙腈洗脫，整個(gè)凈化過程保持流速2～3 mL／min，收集所有流出液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用氮?dú)獯蹈桑?.0 mL乙腈定容。

2.3 線性方程、回收率、精密度和檢出限

以峰面積Y對(duì)農(nóng)藥質(zhì)量濃度X進(jìn)行線性回歸，得到線性方程，以3倍信噪比計(jì)算檢出限，結(jié)果見表2。

表2 81種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)的線性方程，相關(guān)系數(shù)和檢出限

續(xù)表2

選取陜南出產(chǎn)具有代表性的中藥材：天麻、杜 仲、金 銀 花、山 茱 萸，在1，5，10 μg／kg 3個(gè)添加水平下進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個(gè)添加水平做6次平行測(cè)定，其中杜仲在添加1 μg／kg時(shí)，回收率為60.8%～128.9%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為5.9%～21.7%；添 加5 μg／kg時(shí)，回 收 率 為66.0%～127.3%，RSD為7.6%～18.9%；添 加10 μg／kg時(shí)，回 收 率 為69.0%～127.3%，RSD為7.7%～14.9%。天麻的回收率為78.5%～120.8%，RSD為7.6%～13.1%。山茱萸的回收率為71.7%～116.3%，RSD為10.3%～11.6%。金銀花的回收率為72.9%～116.0%，RSD為8.7%～18.9%。

3 結(jié)語

建立了天麻、杜仲、金銀花和山茱萸中81種農(nóng)藥殘留同時(shí)檢測(cè)的氣相色譜－質(zhì)譜法。中藥材中的農(nóng)藥殘留提取液經(jīng)GPC或GPC-SPE固相萃取小柱凈化后用GC-MS法測(cè)定，天麻、杜仲、金銀花和山茱萸的加標(biāo)回收率較高。該方法操作簡(jiǎn)單、凈化效果好、靈敏度高，準(zhǔn)確度和精密度均符合多殘留分析的要求。

［1］Hwangb H，Leem R. Solid-phase microextraction for organochlorine pesticide residues analysis in Chinese herbal formulations［J］. J Chromatogr A，2000，898(2): 245-256.

［2］Leugnek S，Chan K，Chanc L，et al. Systematic evaluation of organochlorine pesticide residues in Chinese materia medica［J］.Phytother Res，2005，19(6): 514-518.

［3］Hajjor M，Afi fi U，Battaha H. Multiresidue pesticide analysis of the medicinal plant Origanum syriacum［J］. Food Addit Contam，2007，24(3): 274-279.

［4］雷軍，李曉華，王巍巍，等.毛細(xì)管氣相色譜測(cè)定人參中有機(jī)氯與擬除蟲菊酯20種農(nóng)藥的殘留［J］.藥物分析雜志，2008，28(4): 567-571.

［5］胡小鐘，儲(chǔ)曉剛，余建新，等.氣相色譜-質(zhì)譜法快速篩選測(cè)定濃縮蘋果汁中105 種農(nóng)藥殘留量［J］.分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2003，22(6): 26-31.

［6］張秀堯，蔡欣欣.QuEChERS法提取液相色譜柱后衍生熒光法測(cè)定蔬菜和水果中21種N-甲基氨基甲酸酯類農(nóng)藥及其代謝產(chǎn)物殘留［J］.中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2008，18(3): 396-398.

［7］曹趙云，牟仁祥，應(yīng)興華，等.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定蔬菜、水果中80 種農(nóng)藥殘留［J］.分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2010，29(10): 1 030-1 035.

［8］張?jiān)?，李耀平，李敏新，?液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定水產(chǎn)品中7 種有機(jī)磷類農(nóng)藥殘留物［J］.分析實(shí)驗(yàn)室，2009，28(增刊): 191-194.

［9］Lehotay S，Kok A de，Hiemstra M，et al. Validation of a fast and easy method for the determination of residues from 229 pesticides in fruits and vegetables using gas and liquid chromatography and mass spectrometric detection［J］. AOAC International，2005，88(2): 595-614.

［10］Nguyen T D，Han E M，Seo M S，et al. A multi-residue method for the determination of 203 pesticides in rice paddies using gas chromatography／mass spectrometry ［J］. Analytica Chimica Acta，2008，619 (1): 67-74.