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(1 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤科，山東 青島 266003； 2 青島市市立醫(yī)院； 3 北京協(xié)和醫(yī)院)

越來越多的研究表明,甲狀腺疾病與乙型肝炎間存在著密切的關(guān)系。甲狀腺自身免疫性疾病和乙型肝炎均參與以甲狀腺為靶器官的細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)[1]。有研究在甲狀腺組織中檢測(cè)到乙型肝炎病毒(HBV)的DNA序列[2]。BRAFV600E突變和RET癌基因在乳頭狀甲狀腺癌(PTC)的發(fā)生、發(fā)展和浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要作用。本文研究HBV是否對(duì)BRAFV600E突變和RET蛋白表達(dá)產(chǎn)生影響，進(jìn)而探討其與PTC的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2010年6月—2012年6月北京協(xié)和醫(yī)院手術(shù)切除PTC標(biāo)本184例，病人男52例，女132例，平均年齡(42±12)歲。感染HBV者66例(A組)，未感染HBV者118例(B組)。所有標(biāo)本均經(jīng)術(shù)后病理檢查確診。

1.2 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.2.1臨床特征 統(tǒng)計(jì)所有研究對(duì)象的性別、確診年齡、腫瘤大小、是否多發(fā)病灶(≥2個(gè)病灶)、TNM分期、包膜外浸潤(rùn)情況、橋本病及結(jié)節(jié)甲狀腺病并發(fā)情況。

1.2.2BRAFV600E突變檢測(cè) 取石蠟包埋的腫瘤組織(多發(fā)病灶取最大者)，行蘇木精-伊紅(HE)染色，確定腫瘤區(qū)域。提取DNA，按照試劑盒(QIA-amp DNA FFPE Tissue Kit)說明書進(jìn)行操作。采用實(shí)時(shí)定量PCR方法進(jìn)行基因檢測(cè)。BRAF的第15外顯子的引物序列：上游為5′-TCATAATGCT-TGCTCTGATAGGA-3′;下游為5′-GGCCAAAA-ATTTAATCAGTGGA-3′。PCR反應(yīng)體系25 μL，內(nèi)含cDNA模板200 ng,0.2 mmol/L的dNTP,引物10 mmol/L,Tris-Hcl(pH 8.3),2.5 mmol/L的MgCl2,1 U的TaqDNA聚合酶及雙蒸水。反應(yīng)條件:95 ℃ 10 min,94 ℃變性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延長(zhǎng)30 s,40個(gè)循環(huán)后,72 ℃延長(zhǎng)10 min。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物6 μL，在25 g/L瓊脂糖凝膠中電泳1 h，在凝膠圖像分析儀上觀察結(jié)果。

1.2.3RET蛋白檢測(cè) 采用免疫組化方法。所有標(biāo)本均連續(xù)切片, 厚度為4 μm。 RET蛋白表達(dá)檢測(cè)應(yīng)用RET蛋白試劑盒(Santa Cruz公司產(chǎn)品), DAB 顯色試劑盒(購(gòu)于武漢博士德生物工程公司)顯色，操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行, 用PBS 代替一抗作陰性對(duì)照，用已知的陽性組織作為陽性對(duì)照。RET結(jié)果判定: 400倍顯微鏡下觀察，腫瘤細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性染色,根據(jù)陽性染色腫瘤細(xì)胞數(shù)占總腫瘤細(xì)胞數(shù)的百分比及其染色強(qiáng)度分別評(píng)分。百分比評(píng)分：陽性細(xì)胞百分比<10%為1分,陽性細(xì)胞百分比10%～40%為2分，陽性細(xì)胞百分比41%～70%為3分，陽性細(xì)胞百分比>70%為4分。染色強(qiáng)度評(píng)分：腫瘤細(xì)胞未見染色為0分,弱染色為1分,中等程度染色為2分,強(qiáng)染色為3分。將百分比評(píng)分與染色強(qiáng)度評(píng)分相乘,得分0～7分為陰性,8～12分為陽性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 兩組臨床病理特征比較

A組結(jié)節(jié)性甲狀腺腫的檢出率高于B組，差異有顯著性(χ2=5.33，P<0.05)；兩組橋本病的檢出率差異無顯著性(P>0.05)。兩組診斷年齡、腫瘤大小、多發(fā)病灶、包膜外浸潤(rùn)、頸部淋巴結(jié)浸潤(rùn)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況比較，差異無顯著性(P>0.05)。見表1。

表1 A組和B組病人臨床病理特征的比較(例(χ/%))

2.2 兩組BRAFV600E突變率比較

PTC病人184例,檢測(cè)到BRAFV600E突變107例,突變率58.2%，其中A組突變率為56.1%(37/66),B組為59.3%(70/118),兩組比較差異無顯著性(P>0.05)。

2.3 兩組RET蛋白表達(dá)比較

PTC組織RET蛋白陽性染色主要分布在甲狀腺癌細(xì)胞胞漿,細(xì)胞核無染色，陽性表達(dá)率為45.7%(84/184)。A組RET蛋白陽性表達(dá)率為40.9%(27/66),B組為48.3%(57/118),兩組間比較差異無顯著性(P>0.05)。

3 討 論

乙型病毒性肝炎是一種世界范圍傳染性疾病，據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道，全球約20億人曾感染過HBV，其中3.5億人為慢性感染者，每年約有100萬人死于HBV感染所致肝衰竭、肝硬化和原發(fā)性肝癌(HCC)。慢性乙型肝炎在我國(guó)有著較高的發(fā)病率,我國(guó)目前的HBsAg陽性人口占總?cè)丝诘?0%～15%，5%～10%發(fā)展為慢性感染，甚至演變成肝硬化、肝癌,嚴(yán)重危害著我國(guó)國(guó)民的健康。甲狀腺惡性腫瘤是頭頸部常見的惡性腫瘤,是內(nèi)分泌系統(tǒng)最常見的一類惡性腫瘤。PTC是發(fā)病率最高的甲狀腺惡性腫瘤,占甲狀腺癌的70%～80%,占全身惡性腫瘤的1%～2%[3]。肝臟發(fā)生病變會(huì)影響下丘腦-垂體-甲狀腺軸的調(diào)控功能，導(dǎo)致血清中甲狀腺激素水平的變化，從而出現(xiàn)甲狀腺功能障礙[4]。HBV不僅能引起慢性肝炎、肝硬化及肝細(xì)胞癌，還能引起一系列的肝外病變。研究結(jié)果顯示, 乙型肝炎病人血清甲狀腺激素含量異常, 可能與肝炎病毒的泛嗜性和病毒直接侵害甲狀腺功能有關(guān)[5]。有研究結(jié)果顯示，HBV與甲狀腺自身免疫性疾病有關(guān)[1]，甲狀腺自身免疫性疾病和結(jié)節(jié)性甲狀腺腫增加患PTC的風(fēng)險(xiǎn)[6]。因此，針對(duì)HBV感染對(duì)PTC發(fā)病的影響的研究越來越引起人們的重視。那么，HBV是否會(huì)對(duì)BRAFV600E、RET基因產(chǎn)生影響，從而進(jìn)一步推動(dòng)PTC的發(fā)生、發(fā)展，至今尚無定論。

本文對(duì)比了HBV感染和非感染PTC病人的臨床、病理及分子生物學(xué)特點(diǎn),結(jié)果顯示，PTC合并HBV感染病人結(jié)節(jié)性甲狀腺腫檢出率高于無HBV感染者，差異有顯著性。既往研究顯示，肝炎病毒具有泛嗜性，并可直接損害甲狀腺功能[5]，從而導(dǎo)致人體內(nèi)甲狀腺激素相對(duì)不足，致使垂體TSH分泌增多，在增多的TSH長(zhǎng)時(shí)期的刺激下，甲狀腺反復(fù)增生，伴有各種退行性變，最終形成結(jié)節(jié)。因此我們推測(cè)，HBV感染引起病人血清甲狀腺激素含量減低，導(dǎo)致TSH分泌增多是PTC合并HBV感染病人結(jié)節(jié)性甲狀腺腫高發(fā)的原因[7]。HBV急性感染、慢性感染及乙型肝炎肝硬化等情況下的甲狀腺激素水平的變化，需要進(jìn)一步的研究。

本文合并HBV感染的PTC病人橋本病檢出率也有增高的趨勢(shì)，但是差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。橋本病屬于自身免疫性疾病，病毒感染是其發(fā)病原因之一。橋本病的人群發(fā)病率不高，而本研究樣本例數(shù)較少，需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究。

絲裂原活化的蛋白激酶(MAPK)通路的激活與PTC的發(fā)生和進(jìn)展有密切關(guān)系，而BRAF激酶的突變?cè)赗af激酶中能最有效地激活MAPK通路[8]。XING等[9]的研究顯示，PTC組織BRAFV-600E突變率為44%。本文研究結(jié)果顯示，PTC組織BRAFV600E突變率為58.2%，與其報(bào)道相符。RET基因與其他基因能形成多種融合基因(RET/PTC-1,RET/PTC-2,RET/PTC-3等),也能激活MAPK信號(hào)通路并可能與癌變有關(guān)[10-12]。而RET基因重排在PTC病人中也非常普遍,其發(fā)生率可達(dá)2.5%～100%[13]。本文的研究結(jié)果顯示，PTC組織RET蛋白陽性表達(dá)率為45.7%，與上述報(bào)道相符。本研究沒有發(fā)現(xiàn)HBV感染與BRAFV600E突變和RET蛋白表達(dá)的相關(guān)性，但HBV感染與PTC其他相關(guān)基因的相關(guān)性有待進(jìn)一步的研究。

總之，本研究結(jié)果顯示，HBV感染的PTC病人結(jié)節(jié)性甲狀腺腫檢出率較非HBV感染者更高；橋本病也有類似的趨勢(shì)，但是差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由于甲狀腺自身免疫性疾病和結(jié)節(jié)性甲狀腺腫增加患PTC的風(fēng)險(xiǎn)[6]，因此，我們推測(cè)HBV感染可能是PTC的潛在危險(xiǎn)因素。本研究結(jié)果未顯示HBV感染與腫瘤大小、多發(fā)病灶、包膜外浸潤(rùn)、頸部淋巴結(jié)浸潤(rùn)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、BRAFV600E突變及RET基因表達(dá)的相關(guān)性，但由于存在地區(qū)限制和樣本量少，故需要進(jìn)一步對(duì)HBV感染與PTC臨床病理及分子生物學(xué)特點(diǎn)的相關(guān)性進(jìn)行研究。

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