趙錦芳，華渤文，王永澤，趙筱，王金華

1(湖北工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程教育部重點實驗室，湖北武漢，430068)

2(工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北武漢，430068)

琥珀酸(又稱丁二酸)，是一種重要的C4平臺化合物，廣泛地應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、農(nóng)藥和塑料等行業(yè)。同時，琥珀酸可以用于合成一些重要的化工產(chǎn)品，如1，4-丁二醇，四氫呋喃，γ-丁內(nèi)酯以及聚丁二酸丁二醇酯(PBS)類生物可降解材料，其世界市場需求量極大［1］。采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)琥珀酸，由于其利用可再生資源，原料來源廣泛，價格低廉，污染小，并且在發(fā)酵過程中可以固定CO2，具有很好的應(yīng)用前景，近年來引起研究者的廣泛關(guān)注［2］。目前，用于發(fā)酵法生產(chǎn)琥珀酸的菌株很多［3-6］，但大多數(shù)菌體代謝途徑復(fù)雜，且由于自身生物合成的限制，對營養(yǎng)要求很高，從而增加了培養(yǎng)基、產(chǎn)物純化和廢棄物處理方面的成本，給工業(yè)化應(yīng)用帶來一定的阻礙。

大腸桿菌(Escherichia coli)由于具有遺傳背景清楚、易操作、易調(diào)控、培養(yǎng)基要求簡單和生長迅速等優(yōu)點，近年來被廣泛用于研究以獲得高產(chǎn)琥珀酸的優(yōu)良菌株。野生型大腸桿菌在有氧條件下主要發(fā)酵產(chǎn)物是乙酸，琥珀酸僅作為TCA循環(huán)的中間產(chǎn)物，不會積累。而在厭氧環(huán)境下，E.coli進(jìn)行混合酸發(fā)酵，產(chǎn)生一系列有機(jī)酸(甲酸、乙酸、琥珀酸、乳酸)和乙醇等，琥珀酸僅占總代謝產(chǎn)物的7.8%左右［7］。因此，必須運用代謝工程手段對現(xiàn)有的菌種進(jìn)行改造，阻斷其他競爭性支路，將代謝流引向琥珀酸的生成。本研究以野生型大腸桿菌E.coli W為起始菌株，利用Red同源重組系統(tǒng)分別敲除其乳酸脫氫酶基因(ldhA)、乙醇脫氫酶基因(adhE)、丙酮酸甲酸裂解酶基因(pflB)、丙酮酸氧化酶基因(poxB)和乙酸激酶基因(ackA)，再通過無氧生長進(jìn)化篩選的方法，獲得了高產(chǎn)琥珀酸的大腸桿菌工程菌。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

野生型E.coli W為本實驗室保藏菌株。重組敲除系統(tǒng)質(zhì)粒pKD46(包含編碼重組系統(tǒng)的基因)、pKD3(包含F(xiàn)RT-cat-FRT閱讀框)、pKD4(包含F(xiàn)RT-kan-FRT閱讀框)、FLP重組酶的表達(dá)質(zhì)粒pCP20由本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑

DNA Marker、PCR Master Mix，購自 Fermentas 公司;細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒，購自天根生物有限公司;氨芐青霉素、卡那霉素，Mersco公司;L-阿拉伯糖，Sigma公司;蛋白胨、酵母粉，Oxiod公司;分析純葡萄糖、NaCl和瓊脂，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;PCR引物合成，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

超凈工作臺，蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司;高壓滅菌鍋，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;恒溫?fù)u床，上海智誠分析儀器制造有限公司;恒溫振蕩培養(yǎng)箱，上海智誠分析儀器制造有限公司;移液器，德國Eppendorf公司;mycycler PCR儀，美國Bio-Rad公司;電擊轉(zhuǎn)化儀器，美國Bio-Rad公司;發(fā)酵罐，Sartorius Stedim，Biotech GmbH 37070，Gottingen Germany。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基:蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 5 g/L。

LB固體培養(yǎng)基:LB液體培養(yǎng)基中加2%的瓊脂。

種子用培養(yǎng)基:NBS培養(yǎng)基［8］中加2%的葡萄糖。

發(fā)酵用培養(yǎng)基:NBS培養(yǎng)基中加10%的葡萄糖。

1.1.4 引物

擴(kuò)增基因的引物名稱和引物序列見表1。

表1 重組基因的同源引物和鑒定引物Table 1 Primers for deletion and identification of adhE and ldhL

1.2 方法

1.2.1 工程菌株的構(gòu)建

利用Red重組系統(tǒng)分別對5個基因進(jìn)行敲除［9］。根據(jù)同源重組原理設(shè)計帶有45 bp左右大小的同源臂的引物，以pKD4或pKD3為模板，PCR克隆卡那霉素(Kan)或氯霉素(Cat)抗性基因。PCR產(chǎn)物回收經(jīng)DpnⅠ限制性內(nèi)切酶消化，膠回收純化含有同源臂抗性基因的片段。用CaCl2法將pKD46轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)過氨芐青霉素抗性平板篩選后得到陽性菌落。將培養(yǎng)過夜的含有pKD46質(zhì)粒的大腸桿菌按1%的接種量轉(zhuǎn)入50 mL LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，同時添加L-阿拉伯糖至0.1%(W/V)，培養(yǎng)至OD600為0.5～0.6。將菌液冰浴20 min，4 000 r/min離心10 min。利用10%的甘油清洗菌體3次，獲得電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。將100 ng的同源重組抗性基因片段加入100 μL的感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴10 min，電擊 (電壓2 500 V)。電擊結(jié)束后，立即向電擊液中加入預(yù)熱的900 μL的 SOC培養(yǎng)基，37℃150 r/min，培養(yǎng)3 h后涂布于抗性平板，篩選陽性重組子，利用菌落PCR進(jìn)一步驗證重組子的正確性。

1.2.2 抗性基因的消除

將pCP20質(zhì)粒轉(zhuǎn)入成功敲除基因的菌株中，30℃培養(yǎng)5 h后，涂于無抗性平板上，42℃過夜培養(yǎng)，熱誘導(dǎo)促進(jìn)FLP重組酶表達(dá)，同時質(zhì)粒也逐漸丟失。

1.2.3 無氧生長進(jìn)化篩選

挑取在無抗性平板上生長良好而在抗性平板上不能生長的菌落8～10個，分別接種于裝滿NBS液體培養(yǎng)基的無氧管中，觀察其生長狀況。反復(fù)3～5輪培養(yǎng)后，挑取在無氧管中生長最好的菌株，保存用于后續(xù)發(fā)酵產(chǎn)酸研究。

1.2.4 發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)

將上述經(jīng)過無氧生長進(jìn)化篩選的大腸桿菌單菌落活化數(shù)代后，接入種子培養(yǎng)基中，200 r/min，37℃條件下?lián)u瓶培養(yǎng)。當(dāng)種子菌體濃度 (OD600)達(dá)到1.0～1.5左右，按5%的接種量接入帶有自動調(diào)節(jié)系統(tǒng)的15 L發(fā)酵罐中，裝液量為10 L，37℃條件下進(jìn)行恒溫厭氧發(fā)酵。發(fā)酵罐條件為:初始糖含量10%，轉(zhuǎn)速200 r/min，以1.2 mol/L KOH 和2.4 mol/L K2CO3的混合液作為中和劑，通過自動流加方式控制pH穩(wěn)定在6.8左右。定時取樣，檢測OD值、葡萄糖濃度、琥珀酸產(chǎn)量及其他雜酸濃度。

1.2.5 發(fā)酵產(chǎn)物分析

OD值采用紫外分光光度計測量，波長選定600 nm;所取發(fā)酵液樣品在10 000 r/min離心10 min，去除細(xì)胞殘留，收集上清液，用于測定殘?zhí)羌捌渌x產(chǎn)物的含量。殘?zhí)呛亢陀袡C(jī)酸檢測采用高效液相色譜法(HPLC)檢測。檢測條件為:Agilent 1200 series反相高效液相色譜儀，色譜柱為Bio-Rad HPX 87H，G1314B VWD檢測器;流動相:0.004 mol/L H2SO4(pH 2.5);流速:0.5 mL/min;進(jìn)樣量:10 μL;示差檢測器檢測;柱溫:35℃［10］。乙醇用氣相色譜儀島津 GC-2014，檢測溫度為 200℃，柱箱溫度為40℃，流速為2 mL/min，分離比為 15∶1，保留時間為2.5 min，內(nèi)標(biāo)為1%的正丙醇。

2 結(jié)果與分析

2.1 大腸桿菌工程菌株WS100的構(gòu)建

利用Red同源重組系統(tǒng)，在E.coli W野生型菌株中分別敲除乳酸脫氫酶基因(ldhA)、乙醇脫氫酶基因(adhE)、丙酮酸-甲酸裂解酶基因(pflB)、丙酮酸氧化酶基因(poxB)和乙酸激酶基因(ackA)，構(gòu)建重組大腸桿菌，所構(gòu)建工程菌代謝途徑如圖1所示。

圖1 厭氧發(fā)酵琥珀酸代謝途徑Fig.1 Matabolic pathway of anaerobic succinic acid fermentation

在厭氧環(huán)境下，E.coli進(jìn)行混合有機(jī)酸發(fā)酵，產(chǎn)生琥珀酸的同時會積累較多的副產(chǎn)物。琥珀酸主要經(jīng)過磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)轉(zhuǎn)變成草酰乙酸(OAA)、蘋果酸和富馬酸這一代謝支路生成。因此，E.coli中丙酮酸的代謝流對于琥珀酸的生成是不利的。通過分子生物學(xué)手段敲除丙酮酸代謝流相關(guān)酶基因，阻斷競爭性代謝途徑，可以將代謝流引入琥珀酸的合成途徑。此外，乳酸、乙醇途徑切斷后，細(xì)胞中累積的NADH為琥珀酸的生成提供了充足的還原力。各基因敲除引物序列見表1(各基因敲除PCR檢測圖略)。然而，初始工程菌無氧生長能力很弱，經(jīng)過多代無氧進(jìn)化篩選，獲得1株在無氧條件下生長良好的菌株，并命名為WS100新菌株。

2.2 工程菌WS100的生長特性

對構(gòu)建的大腸桿菌工程菌株WS100進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)及生長特性分析。結(jié)果表明厭氧條件下五個基因的缺失，造成工程菌株生長初期能量供應(yīng)的減少，與野生型大腸桿菌W相比，發(fā)酵初期生長相對緩慢。如圖2所示，W菌株開始階段生長較快，2 h左右即進(jìn)入對數(shù)生長期，而工程菌WS100起始生長較慢，6 h左右才進(jìn)入對數(shù)生長期。進(jìn)入對數(shù)生長期后，工程菌生長速率迅速增大，在24 h時菌體密度OD600達(dá)到最大值6.48，比野生菌株W提高了近1倍。

圖2 E.coli WS100與E.coli W的生長曲線比較Fig.2 Comparison of the growth curve of E.coli WS100 and E.coli W

2.3 工程菌WS100的發(fā)酵特性

為了驗證重組菌株E.coli WS100在發(fā)酵罐中產(chǎn)琥珀酸的能力，本研究采用帶有pH自動調(diào)節(jié)器的15 L發(fā)酵罐為反應(yīng)器進(jìn)行厭氧發(fā)酵培養(yǎng)。采用NBS液體培養(yǎng)基，裝液量為10 L，初始葡萄糖濃度為10%，控制發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速為200 r/min，溫度為37℃，發(fā)酵過程中用1.2 mol/L KOH和2.4 mol/L K2CO3的混合液作為中和劑。

發(fā)酵結(jié)果如圖3所示，工程菌WS100在低營養(yǎng)成分的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中具有良好的發(fā)酵能力。發(fā)酵液中主要代謝產(chǎn)物為琥珀酸，僅有少量乙酸和乳酸生成，無甲酸、乙醇產(chǎn)生。E.coli WS100和E.coli W都具有較強(qiáng)的耗糖能力，E.coli W從2 h左右耗糖量迅速增加，而工程菌WS100則開始于6 h左右，這與兩者的生長曲線基本吻合。E.coli W在72 h時，發(fā)酵罐中100 g/L的葡萄糖基本完全被消耗掉，E.coli WS100至發(fā)酵結(jié)束共消耗91.87 g/L葡萄糖。野生菌W在厭氧條件下進(jìn)行混合酸發(fā)酵，主要產(chǎn)物包括乳酸、甲酸、琥珀酸、乙酸和乙醇，其中乳酸產(chǎn)量最高，為48.42 g/L，甲酸8.05 g/L，乙酸5.63 g/L，乙醇6.1 g/L，琥珀酸產(chǎn)量很低，僅7.57 g/L。經(jīng)過基因改造后，工程菌WS100發(fā)酵產(chǎn)物主要是琥珀酸，從第8 h開始，琥珀酸產(chǎn)量持續(xù)增加，發(fā)酵72 h共積累琥珀酸70.13 g/L，琥珀酸的生產(chǎn)強(qiáng)度為0.98 g/(L·h)，琥珀酸對葡萄糖的質(zhì)量收率達(dá)到76%。發(fā)酵副產(chǎn)物分別為乙酸5.34 g/L，乳酸0.15 g/L，沒有檢測到甲酸和乙醇的生成。結(jié)果表明，五基因缺失后，工程菌WS100琥珀酸產(chǎn)量明顯提高，是野生菌株W的9.3倍。

圖3 E.coli WS100與E.coli W厭氧發(fā)酵產(chǎn)物檢測Fig.3 Anaerobic fermentation results of E.coli WS100 and E.coli W

3 結(jié)論與討論

近年來，代謝工程策略已經(jīng)廣泛應(yīng)用于大腸桿菌代謝途徑調(diào)控研究中，以獲得高產(chǎn)琥珀酸的優(yōu)良菌株。目前大腸桿菌工程菌的構(gòu)建主要集中于琥珀酸競爭性支路關(guān)鍵酶基因的敲除及過量表達(dá)外源酶基因(丙酮酸羧化酶 pyc、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶ppc、蘋果酸脫氫酶mdh)，以強(qiáng)化琥珀酸代謝支流。Chatterjee［11］等通過敲除 ldhA和 pflB獲得雙基因突變株NZN111，又經(jīng)過自發(fā)突變磷酸轉(zhuǎn)移酶ptsG基因后，獲得高產(chǎn)琥珀酸的菌株AFP111，其琥珀酸產(chǎn)量可達(dá)36 g/L，副產(chǎn)物產(chǎn)量很低。Andersson等以大腸桿菌C600為出發(fā)菌株，分別敲除ldhA、pflB和ptsG三基因，獲得工程株AFP184可同時利用五碳糖和六碳糖，琥珀酸產(chǎn)量為48 g/L［12］。佛羅里達(dá)大學(xué)Jantama等以E.coli C為起始菌株，通過多基因敲除策略，構(gòu)建高產(chǎn)琥珀酸的優(yōu)良菌株KJ134，其琥珀酸產(chǎn)量接近最大理論值，這是目前所報道的琥珀酸產(chǎn)量最高的重組大腸桿菌菌株［13］。國內(nèi)于麗等以ldhA和pflB雙基因缺失菌株JM001為出發(fā)菌株，敲除其ppc基因，同時利用質(zhì)粒過量表達(dá)pck基因，所獲得的工程菌琥珀酸產(chǎn)量為 28.87 g/L［14］。曹劍磊［15］等利用 Xer/dif重組酶系統(tǒng)對E.coli CICIM B0013進(jìn)行代謝途徑的調(diào)控研究，敲除 ackA-pta、ldhA、pflB、adhE，進(jìn)一步對其PTS系統(tǒng)進(jìn)行修飾并適當(dāng)增強(qiáng)ppc表達(dá)劑量，成功獲得1株具備較強(qiáng)琥珀酸生產(chǎn)能力的菌株E.coli CICIM B0013-1050(pTH-ppc)，該菌株厭氧轉(zhuǎn)化葡萄糖36 h，琥珀酸產(chǎn)量達(dá)到36.2 g/L。

本研究通過敲除野生型大腸桿菌W琥珀酸競爭途徑的基因，并進(jìn)一步通過無氧生長進(jìn)化篩選的方法，構(gòu)建得到E.coli WS100使得琥珀酸成為厭氧發(fā)酵過程的主要產(chǎn)物，并且產(chǎn)物濃度、生產(chǎn)強(qiáng)度和質(zhì)量收率均達(dá)到較高水平。E.coli WS100經(jīng)過72 h發(fā)酵，琥珀酸產(chǎn)量可達(dá)到70.13 g/L，琥珀酸的生產(chǎn)強(qiáng)度為0.98 g/(L·h)，葡萄糖-琥珀酸轉(zhuǎn)化率為76%。發(fā)酵液中副產(chǎn)物含量低，乙酸含量為5.34 g/L，乳酸產(chǎn)量僅為0.15 g/L，未檢測到甲酸和乙醇生成。該工程菌可有效利用低營養(yǎng)成分的無機(jī)鹽培養(yǎng)基，在不表達(dá)任何外源基因的條件下可穩(wěn)定高產(chǎn)琥珀酸，具有深入研究的價值和一定的工業(yè)應(yīng)用潛力。

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