馬曉乾 ，劉 欣，鄧 勛，趙紅盈 ，宋小雙 ，范海娟

（1.黑龍江省林業(yè)科學院 森林保護研究所，黑龍江 哈爾濱 150040； 2.東北林業(yè)大學 林學院，黑龍江 哈爾濱150040）

根部損傷及外源物質(zhì)對紅皮云杉幼苗酚酸含量的影響

馬曉乾1，劉 欣1，鄧 勛1，趙紅盈1，宋小雙1，范海娟2

（1.黑龍江省林業(yè)科學院 森林保護研究所，黑龍江 哈爾濱 150040； 2.東北林業(yè)大學 林學院，黑龍江 哈爾濱150040）

以2年生紅皮云杉幼苗為試驗材料，利用高效液相色譜技術(shù)測定不同程度損傷模擬昆蟲取食、外源物質(zhì)茉莉酸(JA)、水楊酸(SA)、茉莉酸和水楊酸(JA+SA)（1：1）混合物處理后，分析不同時間內(nèi)紅皮云杉幼苗體內(nèi)酚酸含量的變化情況。結(jié)果表明：不同程度損傷模擬昆蟲取食紅皮云杉幼苗后，25%損傷不能誘導紅皮云杉幼苗體內(nèi)酚酸類化合物含量發(fā)生顯著的變化；除阿魏酸外，損傷50%和75%后，均不同程度地誘導了紅皮云杉幼苗體內(nèi)酚酸類化合物含量的變化，其中損傷75%誘導酚酸含量的變化較損傷50%持續(xù)時間長；外源物質(zhì)處理后，JA、SA、JA+SA均不同程度地誘導了紅皮云杉幼苗體內(nèi)綠原酸、苯乙酸和水楊酸含量的降低，而苯甲酸、肉桂酸、沒食子酸、阿魏酸及咖啡酸含量與對照相比無顯著差異；經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)JA和SA處理對酚酸類化合物的合成具有拮抗作用，而JA+SA處理并沒有體現(xiàn)2個信號物質(zhì)的疊加，這與2個信號物質(zhì)在酚酸類化合物合成途徑中的拮抗作用的相互作用有關(guān)。說明利用不同誘導處理能夠誘導啟動信號物質(zhì)防御系統(tǒng)，從而達到增強紅皮云杉幼苗抗蟲性是可行的。

紅皮云杉；信號物質(zhì)；酚酸；茉莉酸；水楊酸；根部損傷

寄主植物在長期的進化過程中形成自我防御機制，寄主植物對植食性昆蟲的防御分為化學防御和物理防御，其中化學防御在抵抗植食性昆蟲寄生行為的選擇中起著主導作用[1-3]。寄主植物在受到機械損傷、昆蟲取食、病原菌等其他生物因子侵擾及非生物因子脅迫時，其體內(nèi)次生物質(zhì)會發(fā)生變化[4-5]。酚酸是植物體內(nèi)一種重要的次生性化合物，諸多研究表明，酚酸類化合物是寄主植物化學防御的重要物質(zhì)之一，是合成植物毒素的前提物質(zhì)，對植食性昆蟲具有一定的抗性作用[6]。植物在受到不同種類的昆蟲危害后，受害部位的酚類物質(zhì)會呈現(xiàn)積聚現(xiàn)象[7-8]，如一種尺蛾Epirrita autumnaffroy取食白樺Betula platyphylla和松黃葉蜂Neodiprion sertife危害松樹均可導致寄主樹木酚酸類化合物的增加[9]，同時發(fā)現(xiàn)寄主植物體內(nèi)酚酸含量的高低與植食性昆蟲數(shù)量呈顯著的負相關(guān)[10]。

紅皮云杉Picea koraiensis是我國東北及華北地區(qū)主要的森林及城市綠化樹種，其幼苗長期遭到地下害蟲的危害，給林業(yè)生產(chǎn)和城市綠化造成嚴重的經(jīng)濟損失。目前關(guān)于紅皮云杉幼苗經(jīng)營技術(shù)、地下害蟲對紅皮云杉幼苗危害的發(fā)生規(guī)律及防治技術(shù)已有很多報道[11-12]，但關(guān)于不同誘導處理對紅皮云杉幼苗誘導產(chǎn)生抗性的研究極少，尤其是對不同誘導處理后紅皮云杉幼苗酚酸含量變化的研究還未見報道。該項研究通過損傷模擬地下害蟲取食、噴施外援物質(zhì)茉莉酸（JA）、水楊酸（SA）、茉莉酸和水楊酸混合物（JA+SA）（1：1）誘導處理后，分析不同時間內(nèi)紅皮云杉幼苗酚酸含量的變化情況，以期從化學生態(tài)方面探索出一種調(diào)控紅皮云杉幼苗地下害蟲發(fā)生與危害的方法，應用于林業(yè)生產(chǎn)實踐中。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試驗設計

于2012年6月上旬至7月下旬期間，在黑龍江省伊春市帶嶺區(qū)國家級實驗苗圃基地（東經(jīng) 128°37′44″～ 129°17′51″， 北 緯 46°50′10″～47°21′33″），選擇2年生紅皮云杉幼苗，進行根部損傷（幼苗根部25%、50%、75%的根須進行損傷）模擬昆蟲取食、噴施濃度均為1 mmol·L-1的茉莉酸、水楊酸及茉莉酸和水楊酸混合物溶液處理，以無任何處理紅皮云杉幼苗為對照（CK）。處理后分1、5、10、15、20、30、40 d采集標本（整株），置入便攜式冰箱帶回室內(nèi)，而后放入－20℃冰箱內(nèi)保存。

剪取采集的2年生紅皮云杉幼苗針葉置入烘箱烘干后，用高速粉碎機粉碎，過60目篩后稱取1.0 g樣品，置入50 mL錐形瓶，加入1 mol·L-1NaOH 20 mL，搖勻。密封后水?。?0℃）24 h，超聲振蕩2 h，過濾，濾液靜置24 h，而后加入1 mol·L-1HCl將濾液pH值調(diào)至2，再加入NaCl至飽和狀態(tài)。然后加入乙醚并冷凍，離心機離心（0℃條件下，10 000 r·min-1離心5 min），提取3次，而后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，加入無水硫酸鈉脫水，最后加入2 mL色譜純甲醇使其完全溶解，接著用0.22 μ濾膜將其過濾，作為待測液的提取液[13-14]。

1.2 酚酸標樣的配制

選擇與林木抗蟲性密切相關(guān)的酚酸類物質(zhì)原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸、沒食子酸、水楊酸、肉桂酸、對香豆酸、阿魏酸、丁香酸、香草酸、苯乙酸和苯甲酸為標準樣品[3,15]，分別稱取12種酚酸標準樣品各1 mg，用色譜純甲醇稀釋定容至10 mL后配制成12種酚酸混合標準母液，接著將其依次稀釋為5倍、10倍、25倍、50倍、100倍和1 000倍，配成一系列的酚酸混標溶液，按上述液相色譜測定待測液。

1.3 酚酸含量的分析測定

方法參照文獻[16-19]略作改動，采用Waters高效液相色譜儀測定待測液中的酚酸含量，色譜柱為C18柱，溫度為23℃，2695二極管陣列檢測器檢測，檢測波長為256 nm，自動進樣，進樣速度為0.9 mL·min-1。流動相(V/V/V)：I為甲醇∶H2O∶冰乙酸(12∶80∶8)；Ⅱ為甲醇∶H2O∶冰乙酸(90∶8∶2)。待測樣品酚酸含量根據(jù)12種酚酸混合標液最大吸收峰和峰面積來確定，依據(jù)外標曲線計算酚酸的含量(mg·g-1)，每個待測液樣品的酚酸含量測定重復3次。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析方法

實驗所得數(shù)據(jù)均利用Microsoft Off i ce Excel和SPSS18.0軟件進行分析和處理。采用ANOVA單因素方差分析不同誘導處理間紅皮云杉幼苗針葉內(nèi)酚酸類化合物的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同程度損傷模擬昆蟲取食后紅皮云杉幼苗酚酸含量的時序變化

通過不同程度損傷模擬昆蟲取食紅皮云杉幼苗后，對紅皮云杉幼苗體內(nèi)酚酸含量分離測定，共檢測到苯甲酸、苯乙酸、沒食子酸、肉桂酸、阿魏酸、綠原酸、水楊酸和咖啡酸8種酚酸類化合物，實驗結(jié)果表明其誘導了紅皮云杉幼苗體內(nèi)酚酸含量的變化，因損傷程度不同表現(xiàn)出一定的差異。如圖1所示，25%損傷處理的紅皮云杉幼苗體內(nèi)8種酚酸含量在不同時間內(nèi)與對照相比差異均不顯著，表明25%損傷模擬昆蟲取食未對紅皮云杉幼苗體內(nèi)酚酸含量起到明顯的誘導作用。而50%損傷處理的紅皮云杉幼苗體內(nèi)阿魏酸在1～5 d的含量與對照相比較差異不顯著，而其他6種酚酸類化合物均呈現(xiàn)顯著變化；處理1 d后，苯甲酸、肉桂酸、苯乙酸、咖啡酸與對照相比較均顯著高于對照，綠原酸、水楊酸低于對照；處理5 d后，苯甲酸、肉桂酸、苯乙酸、沒食子酸、咖啡酸含量均高于對照，綠原酸與對照相比較差異不顯著，而水楊酸顯著低于對照；處理10 d后，綠原酸、肉桂酸、咖啡酸顯著高于對照，苯甲酸、苯乙酸、阿魏酸與對照相比較差異不顯著，沒食子酸、水楊酸含量顯著高于對照；處理15 d后，綠原酸、肉桂酸、咖啡酸顯著高于對照，苯甲酸、苯乙酸、沒食子酸、阿魏酸與對照相較差異不顯著，而水楊酸低于對照；處理20 d后，綠原酸、苯乙酸、阿魏酸明顯高于對照，其他5種酚酸類化合物與對照相比較均不顯著；處理30 d后，綠原酸、肉桂酸、咖啡酸略高于對照，而其余5種酚酸類化合物與對照相比較均不顯著；處理40 d后，除咖啡酸略高于對照外，其余7種酚酸類化合物均與對照無明顯差異。以上說明50%損傷模擬昆蟲取食誘導了紅皮云杉幼苗體內(nèi)酚酸含量的變化并且比較顯著。75%損傷處理的紅皮云杉幼苗體內(nèi)苯甲酸、苯乙酸、沒食子酸、咖啡酸在1 d后的含量顯著高于對照，而綠原酸、水楊酸顯著低于對照，阿魏酸、肉桂酸與對照相比較差異不顯著；處理5 d后，苯甲酸、肉桂酸、苯乙酸、沒食子酸、咖啡酸顯著高于對照，綠原酸、水楊酸、阿魏酸顯著低于對照；處理10 d后，苯甲酸、肉桂酸、苯乙酸、咖啡酸均顯著高于對照，綠原酸、沒食子酸、水楊酸、阿魏酸均顯著低于對照；處理15 d后，苯甲酸、肉桂酸顯著高于對照，綠原酸、苯乙酸、水楊酸、咖啡酸與對照相比較均無明顯差異，水楊酸、阿魏酸顯著低于對照；處理20 d后，綠原酸、阿魏酸較顯著高于對照，而其他6種酚酸類化合物含量與對照相比較均無明顯差異；處理30～40 d后，除綠原酸及肉桂酸顯著高于對照外，其余6種酚酸類化合物含量與對照相比較均無明顯差異。說明75%損傷模擬昆蟲取食迅速誘導了紅皮云杉幼苗體內(nèi)酚酸含量的變化，并且這種變化呈現(xiàn)出隨時間的增加出現(xiàn)由強變?nèi)醯倪^程。

圖1 不同程度損傷模擬昆蟲取食紅皮云杉幼苗后其體內(nèi)酚酸含量的變化Fig.1 Changes of phenolic acids contents in P. koraiensis seedlings induced by different damage degrees of simulation insect feeding

2.2 外源物質(zhì)誘導紅皮云杉幼苗體內(nèi)酚酸含量的變化

圖2 外源物質(zhì)誘導紅皮云杉幼苗體內(nèi)酚酸含量的變化Fig.2 Changes of phenolic acids contents in P. koraiensis seedlings induced by exogenous substances

通過對紅皮云杉幼苗噴施外源物質(zhì)茉莉酸、水楊酸、茉莉酸和水楊酸混合物（1∶1）處理后，對紅皮云杉幼苗不同時間內(nèi)酚酸類化合物進行測定，共檢測到苯甲酸、苯乙酸、沒食子酸、肉桂酸、阿魏酸、綠原酸、水楊酸和咖啡酸8種酚酸類化合物，實驗結(jié)果表明，不同誘導處理導致紅皮云杉幼苗體內(nèi)酚酸含量隨時間呈現(xiàn)波動變化，并在同一時間段內(nèi)不同誘導處理表現(xiàn)出一定的差異。如圖2所示，噴施JA處理的紅皮云杉幼苗體內(nèi)綠原酸、苯乙酸、水楊酸、咖啡酸含量在1 d后較對照顯著降低，而苯甲酸、沒食子酸含量與對照相比較無明顯差異，肉桂酸、阿魏酸較對照有所升高；處理5 d后，綠原酸、苯乙酸、水楊酸含量亦顯著低于對照，苯甲酸、肉桂酸含量、沒食子酸、阿魏酸、咖啡酸含量與對照相比較無明顯差異；處理10 d后，綠原酸、肉桂酸、苯乙酸、水楊酸含量顯著低于對照，苯甲酸、沒食子酸、阿魏酸、咖啡酸含量較對照有所升高；處理15 d后，綠原酸、水楊酸含量較對照顯著降低，苯甲酸、肉桂酸、苯乙酸、阿魏酸、咖啡酸含量與對照相比較無明顯差異，沒食子酸含量顯著高于對照；處理20 d后，綠原酸、水楊酸含量與對照相比較亦明顯低于對照，其余6種酚酸類化合物與對照相比較均無明顯差異；處理30～40 d后，除綠原酸、肉桂酸、苯甲酸含量略低于對照外，其余5種酚酸類化合物與對照相比較亦無明顯差異。說明綠原酸、水楊酸和苯乙酸在明顯降低，表明JA對紅皮云杉幼苗體內(nèi)綠原酸、水楊酸及苯乙酸的積累具有拮抗作用，抑制了綠原酸、水楊酸及苯乙酸化合物的合成。噴施SA處理的紅皮云杉幼苗體內(nèi)綠原酸含量在處理1～40 d后均低于對照，苯乙酸、水楊酸含量在1～15 d后亦低于對照，而后與對照無明顯差異；肉桂酸含量在1、5 d后顯著高于對照，10 d后低于對照，在15～40 d與對照相比較無明顯差異；其余4種酚酸類化合物與對照相比較無明顯差異。說明綠原酸、水楊酸和苯乙酸均表現(xiàn)為明顯降低，表明噴施SA抑制或者阻止了紅皮云杉內(nèi)綠原酸、水楊酸及苯乙酸化合物的合成。噴施JA+SA處理的紅皮云杉幼苗體內(nèi)綠原酸含量在1～40 d后均低于對照，苯乙酸含量在1～10 d時顯著低于對照，之后與對照無明顯差異；肉桂酸含量在1 d后顯著高于對照，5～10 d后低于對照，而后與對照無明顯差異；水楊酸含量在1～15 d 后顯著低于對照，而后與對照基本一致；咖啡酸含量1 d后顯著低于對照，而后與對照無明顯差異；其余3種酚酸類化合物含量與對照相比較亦無明顯差異。

3 討 論

本項研究以不同誘導處理對紅皮云杉幼苗體內(nèi)酚酸類化合物含量的變化為研究目的，探明不同處理后酚酸類化合物在紅皮云杉幼苗誘導抗蟲性中的表達。酚酸的種類及其含量與寄主植物的抗蟲性密切相關(guān)，酚酸的種類和作用方式因植物的種類不同而不同。如抗性強的銀白楊Populus alba和毛白楊Populus tomentosa樹皮內(nèi)的香豆酸、鄰二苯酚和對羥基苯甲酸的含量，前者低于后者[20]。楊樹韌皮部中的咖啡酸、肉桂酸、丁香酸對青楊脊虎天牛Xylotrechus rusticus具有較明顯的趨避作用，而苯甲酸、苯乙酸、咖啡酸是興安落葉松中重要的防御物質(zhì)[3,21]。在本項研究中，通過不同程度損傷模擬昆蟲取食后，紅皮云杉幼苗體內(nèi)苯甲酸、肉桂酸、苯乙酸、沒食子酸及咖啡酸含量均較對照顯著增加，這一現(xiàn)象說明這幾種酚酸很有可能是紅皮云杉幼苗抗蟲性的表達物質(zhì)。

同時，在本項研究中不同程度損傷模擬昆蟲取食紅皮云杉幼苗后，25%損傷不能誘導紅皮云杉幼苗體內(nèi)酚酸類化合物含量發(fā)生顯著的變化；除阿魏酸外，損傷50%和75%后，均不同程度地誘導了紅皮云杉幼苗體內(nèi)酚酸類化合物含量的變化，其中損傷75%誘導酚酸含量的變化較損傷50%持續(xù)時間長，說明植物體內(nèi)酚酸含量的變化與損傷程度具有一定的相關(guān)性[22]。這一結(jié)果與損傷是誘導植物體內(nèi)酚酸類化合物合成的重要因子的觀點一致[23]。

通過噴施不同外源物質(zhì)誘導紅皮云杉幼苗后發(fā)現(xiàn)，茉莉酸、水楊酸、茉莉酸+水楊酸均不同程度地誘導了紅皮云杉幼苗體內(nèi)綠原酸、苯乙酸和水楊酸含量的降低，有研究資料顯示，綠原酸有利于提供昆蟲抗氧化的保護，其防御作用較弱[24-25]，如果是這樣，那么綠原酸含量的降低在某種程度上是減弱了昆蟲抗氧化的保護，從而不利于植食性昆蟲對寄主植物的取食。水楊酸是在植物體內(nèi)表達抗性的酚酸類化合物之一，在該項研究中發(fā)現(xiàn)，噴施水楊酸使得紅皮云杉幼苗體內(nèi)水楊酸的含量反而降低，這一現(xiàn)象可能是由于過量的外源物質(zhì)水楊酸抑制了水楊酸在植物體內(nèi)的合成或表達以及其他與其相關(guān)的防御物質(zhì)的合成，噴施茉莉酸、茉莉酸+水楊酸與噴施水楊酸結(jié)果相似，這些信號物質(zhì)能夠誘導一系列次生物質(zhì)的合成和基因的表達，其中有些是相同的，它們之間彼此聯(lián)系和互相交流[26]。從研究結(jié)果看，噴施茉莉酸、水楊酸、茉莉酸+水楊酸后，紅皮云杉幼苗體內(nèi)苯甲酸、肉桂酸、沒食子酸、阿魏酸及咖啡酸含量與對照相比較無顯著差異，但筆者發(fā)現(xiàn)茉莉酸處理的酚酸類化合物含量略高于水楊酸處理，這種差異可能源于對苯丙氨酸解氨酶誘導的差異，苯丙氨酸解氨酶是苯丙烷生物代謝途徑中的第一個酶，苯丙烷能夠調(diào)節(jié)酚酸類化合物的合成[27-28]。從以上分析可以看出，茉莉酸和水楊酸處理對酚酸類化合物的合成具有拮抗作用，而茉莉酸+水楊酸處理并沒有體現(xiàn)2個信號物質(zhì)的疊加，這與2個信號物質(zhì)在酚酸類化合物合成途徑中的拮抗作用的相互作用有關(guān)。

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Effects of root damage and exogenous substances on phenolic acids content in Picea koraiensis seedlings

MA Xiao-qian1, LIU Xin1, DENG Xun1, ZHAO Hong-ying1, SONG Xiao-shuang1, FAN-Hai-juan2
(1. Institute of Forest Protection, Heilongjiang ForestryAcademy, Harbin 150040, Heilongjiang, China; 2. College of Forestry,Northeast Forestry University, Harbin 150040, Heilongjiang, China)

By taking 2-year-old Picea koraiensis seedlings as tested materials, using high performance liquid chromatography, the phenolic acids content changes in P. koraiensis seedlings in different times were determined after simulating insects feeding under different degree of seedling injury and treated with Jasmonate(JA), salicylic(SA) or Jasmonate and salicylic mixture(JA+SA)(1∶1).The results show that after the seedlings were damaged by 25%, the trauma could not induced the phenolic acids content signif i cant change in the seedlings; Except ferulic, after damaged by 50% and 75%, the traumas induced the phenolic acids content signif i cant change in different degree, the trauma 75% induced the phenolic acids content change lasting more time than the trauma 25%. After treated with exogenous substances, JA, SA, JA + SA induced the reduction of P. koraiensis seedlings chlorogenic acid, phenylacetic acid and salicylic acid by varying degrees, while benzoic acid, cinnamic acid, gallic acid, ferulic acid and caffeic acid contents in the seedlings had not signif i cant differences compared with the photography; The analysis results proved that the JA, SA treatments had antagonism on synthesis of phenolic compounds, while JA + SA treatments did not ref l ect the substance of the superposition of the two signals, and this ascribes the mutual effects of two signal substances in phenolic acids synthesis pathway antagonism interactions, and indicates that different induction treatments can induce to start the signal substances defensive system, so as to achieve the feasibility of enhancing P. koraiensis seedlings’ insect-resistance.

Picea koraiensis; signal substances; phenolic acids; jasmonate acid; salicylic acid; root damage

2012-11-15

黑龍江省森林工業(yè)總局應用研究項目(sgzjY2010017)

馬曉乾（1979-），男，寧夏人，助理研究員，碩士，主要從事森林蟲害綜合治理和昆蟲化學生態(tài)研究；E-mail： 369086324@qq.com

S763

A

1673-923X(2013)03-0051-06

[本文編校：謝榮秀]