摘 要：本文研究了不同菌齡、預(yù)處理時(shí)間、酶解時(shí)間、酶濃度等對(duì)產(chǎn)黃青霉菌原生質(zhì)體制備率與再生率的影響，確定了有利制備率與再生率提高的最佳條件。

關(guān)鍵詞：產(chǎn)黃青霉菌 原生質(zhì)體制備 原生質(zhì)體再生

中圖分類(lèi)號(hào)：R965 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1672-3791（2013）04（a）-0123-01

原生質(zhì)體融合能將遺傳特性不同的兩親本原生質(zhì)體融合雜交，篩選后獲得集雙親優(yōu)良性狀于一體的穩(wěn)定融合子[1]。當(dāng)前使用最廣泛的就是以PEG為融合劑的化學(xué)法，具有經(jīng)濟(jì)、方便、可重復(fù)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[2]。產(chǎn)黃青霉菌是原生質(zhì)體融合的常用菌種，原生質(zhì)體制備是融合的前提。本文探討了在菌齡、預(yù)處理時(shí)間、酶解時(shí)間、酶濃度等不同水平下，同時(shí)有利于制備率與再生率提高的綜合條件，為提高產(chǎn)黃青霉菌與其他菌的融合提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 產(chǎn)黃青霉菌

1.1.2 試劑

（1）緩沖液（CPB）：0.2 mol/L、pH6.0的檸檬酸緩沖溶液中。按文獻(xiàn)[4]配制。

（2）高滲緩沖液：以CPB配制的0.8 mol /L山梨醇。

（3）酶液：以CPB配制。（4）預(yù)處理劑：0.05 mol/L EDTA-Na2溶液+0.2%β-巰基乙醇，以CPB配制。

1.1.3 培養(yǎng)基

（1）液體完全培養(yǎng)基（YEPD）：參照文獻(xiàn)[3]。（2）再生培養(yǎng)基（YEPDS）：參照文獻(xiàn)[3]。

以上均以0.73×105Pa滅菌30min。

1.2 方法

1.2.1 原生質(zhì)體制備

參照文獻(xiàn)[4]。

1.2.2 原生質(zhì)體再生

參照文獻(xiàn)[4]。

1.2.3 影響原生質(zhì)體制備率與再生率的單因素試驗(yàn)

（1）菌齡：14 h，16 h，18 h，20 h。（2）預(yù)處理時(shí)間：10 min，20 min，30 min。

（3）酶解時(shí)間：15 min，30 min，45 min，60 min，90 min，120 min。（4）酶濃度：0.5%，1.0%，2.0%，4.0%。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理?xiàng)l件對(duì)產(chǎn)黃青霉菌原生質(zhì)體制備率與再生率的影響

2.1.1 菌齡對(duì)制備率與再生率的影響 本試驗(yàn)研究了同時(shí)接種后培養(yǎng)12 h、14 h、16、18 h菌齡的菌體相對(duì)應(yīng)的制備率依次為94.8%、91.1%、83.4%、71.7%，再生率依次為2.5%、3.0%、3.3%、3.9%。試驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，再生率隨著菌齡延長(zhǎng)，產(chǎn)黃青霉原生質(zhì)體的制備率逐漸降低，而再生率則逐漸升高。

2.1.2 預(yù)處理時(shí)間對(duì)制備率與再生率的影響

預(yù)處理時(shí)間10 min、20 min、30 min對(duì)應(yīng)的制備率依次為80.3%、88.1%、91.9%，再生率依次為4.2%、3.6%、1.9%。試驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，預(yù)處理對(duì)原生質(zhì)體的制備有促進(jìn)作用，制備率隨預(yù)處理時(shí)間延長(zhǎng)而升高；但是對(duì)細(xì)胞壁的再生起副作用，再生率隨時(shí)間延長(zhǎng)而下降。

2.1.3 酶解時(shí)間對(duì)制備率與再生率的影響

酶解時(shí)間15 min、30 min、45 min、60 min、90 min、120 min對(duì)應(yīng)的制備率依次為55.1%、85.1%、89.3%、91.0%、93.2%、95.2%，再生率依次為4.2%、3.3%、2.3%、1.1%、0.9%、0.6%，試驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)在120 min內(nèi)，原生質(zhì)體形成率與酶作用時(shí)間成正比遞增，120 min左右細(xì)胞基本原生質(zhì)體化，但是再生率在15 min時(shí)最高，隨時(shí)間延長(zhǎng)而降低。

2.1.4 酶濃度對(duì)制備率與再生率的影響

對(duì)0.5%、1.0%、2.0%、4.0%的酶濃度對(duì)制備率與再生率進(jìn)行試驗(yàn)，對(duì)應(yīng)的制備率依次為63.25%、73.58%、88.57%、90.68%，再生率為4.15%、3.55%、3.23%、1.60%。結(jié)果可見(jiàn)，隨著酶濃度的增加原生質(zhì)體的制備率升高，再生率降低。

2.2 優(yōu)化條件下的產(chǎn)黃青霉原生質(zhì)體制備率與再生率

綜合以上試驗(yàn)結(jié)果可以得出如下結(jié)論：菌齡16 h，以2.0%蝸牛酶進(jìn)行酶解，酶解溫度30℃，酶解時(shí)間30 min，0.8 mol/L山梨醇做滲透壓穩(wěn)定劑，以0.05 mol/L EDTA-Na2溶液和0.2%β-巰基乙醇為預(yù)處理劑處理20min為產(chǎn)黃青霉原生質(zhì)體制備率和再生率均較高的最佳條件。在此優(yōu)化條件下，原生質(zhì)體形成率為85.1%，再生率為3.8%。

3 討論

3.1 制備率

菌體的原生質(zhì)體制備主要是細(xì)胞的去壁，菌齡與細(xì)胞壁密切相關(guān)。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌體細(xì)胞壁較薄，對(duì)酶更加敏感；穩(wěn)定期細(xì)胞壁厚，不利于酶解，制備率反而會(huì)隨菌齡的延長(zhǎng)而降低。

去除細(xì)胞壁是對(duì)菌體的一種破壞，破壞時(shí)間越長(zhǎng)原生質(zhì)體生成量越多。EDTA-Na2能產(chǎn)破壞黃青霉菌細(xì)胞壁外層，也利于蝸牛酶滲入內(nèi)層促進(jìn)細(xì)胞壁的降解和避免影響酶活；β-巰基乙醇可破環(huán)細(xì)胞壁碳骨架中的二硫鍵，促進(jìn)擴(kuò)散進(jìn)入內(nèi)壁層，因而預(yù)處理時(shí)間越長(zhǎng)原生質(zhì)體制備率越高。因此，在本試驗(yàn)所選擇的酶解時(shí)間和酶濃度范圍內(nèi)原生質(zhì)體的制備率與二者呈正相關(guān)。

3.2 再生率

菌體的菌齡越長(zhǎng)，細(xì)胞壁強(qiáng)度越高，失去細(xì)胞壁后更利于壁的再生，所以隨著菌齡的延長(zhǎng)再生率也升高。

菌體被破壞的越嚴(yán)重其細(xì)胞壁的再生也就越困難。β-巰基乙醇對(duì)細(xì)胞本身也具有毒性，所以預(yù)處理時(shí)間越長(zhǎng)原生質(zhì)體再生率也就越低。由于蝸牛酶是混合酶，混有蛋白酶和核酸酶等對(duì)原生質(zhì)體有損傷作用的酶類(lèi)，故不宜長(zhǎng)時(shí)間或高濃度的將原生質(zhì)體暴露其中。目前已有文獻(xiàn)表明，在膜外有殘余細(xì)胞壁組分時(shí)會(huì)更有利于壁的再生。因此，選擇合適的酶濃度及酶解時(shí)間以減少對(duì)菌體的破壞而有利于對(duì)原生質(zhì)體的再生是有利的。

參考文獻(xiàn)

[1] 羅立，潘力，鄭穗平.細(xì)胞工程[M].廣州：華南理工大學(xué)出版社，2003：5-19.

[2] 王娟娟，賈彥軍.微生物原生質(zhì)體融合方法的綜述[J].畜牧獸醫(yī)科技信息，2005，10：17-19.

[3] 文鐵橋，趙學(xué)慧.克魯維酵母與釀酒酵母屬間原生質(zhì)體融合構(gòu)建高溫酵母菌株[J].菌物系統(tǒng)，1999，18（1）：89-93.

[4] 龔建根，劉頤屏.產(chǎn)黃青霉菌和頂頭孢霉菌原生質(zhì)體形成、再生和屬間融合[J].中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志，1991（5）.