張振華, 沈增麗, 侯傳玲, 宋春嬌, 孫愛(ài)靜

(1. 紹興市人民醫(yī)院&浙江大學(xué)紹興醫(yī)院病理科, 紹興 312000;2. 溫州醫(yī)學(xué)院第一臨床學(xué)院病理科, 溫州 325003)

·論 著·

人源性前列腺癌動(dòng)物模型的初步建立

張振華2, 沈增麗2, 侯傳玲1, 宋春嬌1, 孫愛(ài)靜1

(1. 紹興市人民醫(yī)院&浙江大學(xué)紹興醫(yī)院病理科, 紹興 312000;2. 溫州醫(yī)學(xué)院第一臨床學(xué)院病理科, 溫州 325003)

目的 建立中國(guó)人同一起源腫瘤不同惡性潛能前列腺癌動(dòng)物模型，為研究前列腺癌轉(zhuǎn)移進(jìn)展機(jī)制及激素抵抗的發(fā)生機(jī)制提供理想的動(dòng)物模型。方法 采用組織塊外科原位移植法將人前列腺癌組織分別移植到虛擬去勢(shì)組及去勢(shì)組雄性裸小鼠前列腺部，成瘤后進(jìn)行鼠間傳代移植，選取虛擬去勢(shì)組原位移植瘤、移植淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移瘤、去勢(shì)組第4代淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移瘤體外培養(yǎng)建立細(xì)胞系，應(yīng)用Boyden Chamber細(xì)胞運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷徙轉(zhuǎn)移能力，描繪細(xì)胞生長(zhǎng)曲線分析細(xì)胞增殖及激素依賴(lài)性，裸小鼠皮下異種移植瘤模型檢測(cè)成瘤率、腫瘤濕重及浸潤(rùn)范圍驗(yàn)證不同代移植瘤細(xì)胞在裸小鼠異種移植的生長(zhǎng)狀態(tài)。結(jié)果 第1代虛擬去勢(shì)組成瘤率30%，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，取移植瘤反復(fù)原位傳代移植第3代成瘤率50%，盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率40%。去勢(shì)組原代移植以及來(lái)自虛擬去勢(shì)組的原位移植瘤反復(fù)原位移植均未見(jiàn)移植瘤，源自虛擬去勢(shì)組淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移瘤組織反復(fù)原位傳代移植至第4代，成瘤率33%，其中一只可見(jiàn)盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。三種細(xì)胞系細(xì)胞生長(zhǎng)、遷徙以及體外裸小鼠成瘤率均有顯著差別(P＜0.05)。結(jié)論 裸小鼠前列腺癌原位移植反復(fù)傳代可增強(qiáng)腫瘤成瘤率、轉(zhuǎn)移力等惡性指標(biāo)。以裸小鼠淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移瘤接種去勢(shì)裸小鼠可篩選出激素非依賴(lài)性異種移植瘤及轉(zhuǎn)移瘤。

前列腺癌; 原位異種移植; 腫瘤模型; 雄激素抵抗

人類(lèi)前列腺癌的發(fā)生過(guò)程非常緩慢，欲復(fù)制出與人類(lèi)前列腺癌病理過(guò)程相似的動(dòng)物模型比較困難[1]。研究表明，犬類(lèi)是動(dòng)物中唯一可能自然發(fā)生前列腺上皮內(nèi)腫瘤性增生和前列腺腺癌的動(dòng)物[2]，且與人類(lèi)一樣具有高齡發(fā)生、易于轉(zhuǎn)移及晚期發(fā)生雄性激素抵抗等特點(diǎn)，被認(rèn)為是前列腺癌研究的理想模型。但由于犬類(lèi)實(shí)驗(yàn)較難控制且癌的自發(fā)率低，實(shí)驗(yàn)費(fèi)用高等原因，研究受到很大的限制。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，轉(zhuǎn)基因[3～5]和基因敲除動(dòng)物模型[5～6]可成為研究和認(rèn)識(shí)單一基因或數(shù)個(gè)基因在前列腺癌發(fā)生發(fā)展中作用的有效動(dòng)物模型，但由于技術(shù)不成熟不能被廣泛應(yīng)用。誘發(fā)性嚙齒類(lèi)動(dòng)物前列腺癌模型在發(fā)病部位、病理過(guò)程和組織分化特點(diǎn)與人類(lèi)具有相似之處[7～8]，利用已經(jīng)建系的人類(lèi)前列腺癌細(xì)胞株種植于免疫缺陷動(dòng)物體內(nèi)所建立的異種移植動(dòng)物模型，雖然在研究腫瘤發(fā)生最初時(shí)間方面存在一定缺陷，但在研究前列腺癌由雄激素依賴(lài)型向抵抗型演進(jìn)、轉(zhuǎn)移機(jī)制、藥物療效等方面更加有用。

常用的人前列腺癌細(xì)胞系有LNCaP、PC3、CRW-22和LuCa-23等[9]，均為來(lái)源于美國(guó)人的細(xì)胞株，從中國(guó)人前列腺癌患者新鮮標(biāo)本中分離并建立具有不同惡性潛能的前列腺癌異種移植動(dòng)物模型鮮見(jiàn)報(bào)道，這在一定程度上限制了對(duì)中國(guó)人群或亞洲人群前列腺癌的深入研究。

本課題采用本院未經(jīng)治療的前列腺癌患者新鮮手術(shù)標(biāo)本, 將腫瘤直接進(jìn)行雄性BALB/c裸小鼠和去勢(shì)雄性BALB/c裸小鼠的前列腺進(jìn)行原位移植, 去勢(shì)組虛擬雄激素消融治療后腫瘤進(jìn)展的情況, 傳代多次直至出現(xiàn)不同惡性潛能腫瘤, 對(duì)表現(xiàn)出對(duì)激素的依賴(lài)程度以及原位移植、轉(zhuǎn)移等不同惡性潛能的移植瘤建立細(xì)胞系并進(jìn)行穩(wěn)定原位移植，旨在為研究前列腺癌的進(jìn)展及雄激素抵抗發(fā)生提供良好動(dòng)物模型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本獲取及處理 紹興市人民醫(yī)院住院接受手術(shù)切除的前列腺癌標(biāo)本，離體后新鮮狀態(tài)下放入無(wú)菌PBS中低溫保存轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)室，無(wú)菌操作取0.5 cm3大小，用于移植，剩余部分10%中性福爾馬林固定后行常規(guī)病理學(xué)檢查。

1.1.2 主要試劑和抗體 膠原酶、人工合成雄激素R1881購(gòu)自Sigma公司; BD Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)自上海杰海生物科技有限公司; 戊巴比妥鈉購(gòu)自中國(guó)醫(yī)藥上海化學(xué)試劑公司; 免疫組化用一抗包括雄激素受體(AR)、甲基?；o酶消旋酶(P504S)、前列腺特異性抗原抗體購(gòu)自福州邁新生物科技有限公司。采用全自動(dòng)免疫組化儀(Leica Bond-Max)配套染色液購(gòu)于Leica公司。

1.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 SPF級(jí)4～6周齡雄性BALB/c裸小鼠, 體質(zhì)量22～25 g, 購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司[SCXK(滬)2007-0005 ], 墊料飼料及飲水均無(wú)菌處理。在紹興市醫(yī)學(xué)研究中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[SYXK(浙)2009-0139]。動(dòng)物分為虛擬去勢(shì)組和去勢(shì)組，實(shí)驗(yàn)一周前實(shí)施手術(shù)。

1.2.2 去勢(shì)/虛擬去勢(shì)手術(shù)及原位移植瘤模型的建立 體積分?jǐn)?shù)1%戊巴比妥鈉(60～80 mg/kg)麻醉裸小鼠后，仰臥位消毒下腹部皮膚及生殖器，去勢(shì)手術(shù)分別在兩側(cè)陰囊前部剪開(kāi)約1 cm左右橫行開(kāi)口后游離睪丸摘除并縫合; 虛擬去勢(shì)術(shù)牽出睪丸附睪后復(fù)位縫合; 移植瘤建立采取下腹部正中線近生殖器處剪開(kāi)一約1 cm左右的縱行開(kāi)口。游離肌肉剪開(kāi)腹膜，游離膀胱并將兩側(cè)脂肪組織推開(kāi)，牽出部分膀胱及精囊腺充分暴露前部前列腺(左右各一葉)，中間可見(jiàn)管狀小溝，用眼科剪剪開(kāi)3 mm左右開(kāi)口后將事先準(zhǔn)備好的組織塊嵌入，用22號(hào)針頭7-0可吸收縫線縫合固定，臟器復(fù)位后將腹膜、肌肉、皮膚逐層縫合。

1.2.3 細(xì)胞系裸小鼠背部皮下移植瘤鑒定細(xì)胞系成瘤能力 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)細(xì)胞系制成單細(xì)胞懸液(2×106/0.2 ml), 用1 ml注射器6號(hào)針頭接種于裸小鼠雙側(cè)背部皮下，每種細(xì)胞系接種20只，虛擬去勢(shì)裸小鼠和去勢(shì)裸小鼠各10只。隔日觀察并記錄腫瘤生長(zhǎng)狀態(tài)。8周后處死裸小鼠解剖測(cè)定腫瘤濕重。

1.3 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.3.1 細(xì)胞系的建立 選取A組初代原位移植瘤灶(LA1)、A組原位移植第三代淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移瘤灶(LAN1)、B組第4代淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶(LBN1)0.5～1 cm3，無(wú)菌RPMI1640培養(yǎng)液中冰盒中保存轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)室，無(wú)菌操作臺(tái)下PBS沖洗干凈后眼科剪剪切30 min以上至乳糜狀，PBS稀釋, 800 r/min離心, 棄上清置含15%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液體外培養(yǎng)，貼壁后換液.每日觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，待細(xì)胞融合成片貼壁后棄培養(yǎng)液用D-hanks沖洗2次，加入0.1%胰酶(含EDTA)溶液2 ml, 輕搖培養(yǎng)瓶, 使消化液鋪滿細(xì)胞,消化2～3 min。顯微鏡下觀察至細(xì)胞變圓、融合細(xì)胞彼此分離少數(shù)細(xì)胞懸浮后加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液10 ml終止消化，反復(fù)吹打使細(xì)胞分散，將細(xì)胞懸液分裝于兩個(gè)培養(yǎng)瓶中做好標(biāo)記 ，37℃、5%CO2孵育箱靜置培養(yǎng)，傳代，建立上述腫瘤體外培養(yǎng)細(xì)胞系。

1.3.2 細(xì)胞計(jì)數(shù)及增殖曲線的描繪 細(xì)胞系以3×104/孔的密度接種于24孔培養(yǎng)板，每個(gè)細(xì)胞系一個(gè)培養(yǎng)板，37 ℃、5%CO2孵育箱培養(yǎng)過(guò)夜后，用胰酶消化細(xì)胞后加培養(yǎng)液吹打混勻，取細(xì)胞懸液用0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)，每24小時(shí)計(jì)數(shù)一次每次消化計(jì)數(shù)3孔求平均值。分別以時(shí)間為橫坐標(biāo)及細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)描繪生長(zhǎng)曲線。

1.3.3 TRANSWELL侵襲實(shí)驗(yàn) 將凍存于-80℃的BD Matrigel放入4 ℃冰箱過(guò)夜使其變成液態(tài)。冰塊上用無(wú)血清PRMI1640將基質(zhì)膠稀釋到0.5 mg/ml上室每孔60 μl放入37 ℃培養(yǎng)箱中靜置半小時(shí)。將細(xì)胞系培養(yǎng)液倒出, D-hanks液清洗兩遍后加0.1%胰酶消化2～3 min加培養(yǎng)液吹打瓶底制成單細(xì)胞懸液, 計(jì)數(shù)板細(xì)胞計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞密度為105/ml, 200 μl/孔加入上室, 上室預(yù)先用無(wú)血清培養(yǎng)基洗一次。用無(wú)菌鑷夾取插件, 下室加500 μl/孔完全培養(yǎng)基放入CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取出上室, 棄去孔中培養(yǎng)液, 用PBS清洗2遍, 甲醇固定30 min, 將小室適當(dāng)風(fēng)干。0.1%結(jié)晶紫染色20 min, 用棉簽輕輕擦掉上層沒(méi)有遷移的細(xì)胞, 用PBS洗3遍。400倍顯微鏡下隨即5個(gè)視野觀察細(xì)胞, 記數(shù)并計(jì)算侵襲指數(shù)。

1.4 病理學(xué)檢查

1.4.1 常規(guī)標(biāo)本 手術(shù)切除標(biāo)本及移植瘤離體后，10%中性福爾馬林固定12～24 h，常規(guī)脫水、石蠟包埋，制備4 μm連續(xù)切片，用于HE染色及免疫組化染色。

1.4.2 免疫組化染色 Leica Bond-Max全自動(dòng)免疫組化儀程序設(shè)定為: 72 ℃脫蠟2次, 室溫1次, 酒精沖洗3次，緩沖液沖洗3次。修復(fù)液pH9.0ER2抗原修復(fù)液, 100 ℃抗原修復(fù)20 min, 35 ℃緩沖液沖洗3次, 室溫3 min。特異性過(guò)氧化物酶阻斷10 min，緩沖液沖洗3次。一抗室溫孵育30 min，緩沖液沖洗3次，增效液(Post primary) 8 min，緩沖液沖洗3次。二抗8 min，緩沖液沖洗2次，各2 min，去離子水1次。DAB 10 min，去離子水沖洗3次。蘇木素復(fù)染5 min，去離子水沖洗1次，緩沖液沖洗1次，去離子水沖洗1次。梯度酒精脫水、透明,中性樹(shù)膠封固，顯微鏡檢。

結(jié)果判定: AR定位于細(xì)胞核，PSA和P504S定位于細(xì)胞質(zhì)，陽(yáng)性細(xì)胞比率超過(guò)20%視為陽(yáng)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

計(jì)量資料采用多個(gè)樣本均數(shù)方差分析，使用SPSS17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，取α=0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料

77歲男性, PSA 13 ng/ml, 術(shù)前未經(jīng)過(guò)任何治療。大體觀，彌漫增大前列腺根治標(biāo)本, 大小5 cm×5 cm×4 cm。鏡檢癌細(xì)胞輕度異形，排列成不規(guī)則腺管狀(圖1A, HE×200)，免疫組化示AR、P504S、PSA陽(yáng)性(圖1B、C、D, ×200)組織學(xué)診斷: 彌漫浸潤(rùn)性生長(zhǎng)前列腺癌，Gleason評(píng)分3+3=6。

2.2 腫瘤原位移植瘤形成

第1代移植9周后解剖裸小鼠，10只虛擬去勢(shì)組中3只在前列腺腫瘤接種部位形成移植瘤，呈白色魚(yú)肉狀質(zhì)韌，邊界尚清楚，無(wú)包膜(圖2), 成瘤率30%。無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。去勢(shì)組未見(jiàn)移植瘤形成。取原位移植瘤傳代移植第2代成瘤率50% 無(wú)肉眼所見(jiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，第3代成瘤率50%，其中4只見(jiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，B組未見(jiàn)移植瘤形成。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移瘤接種B組裸小鼠初代(總第4代)1只可見(jiàn)原位移植瘤，成瘤率10%，用該移植瘤反復(fù)傳代，第2代(總第5代)、第3代(總第6代)、第4代(總第7代)原位成瘤率分別為10%、10%和30%，第4代其中一只可見(jiàn)盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(表1)。

2.3 細(xì)胞增殖及激素依賴(lài)性分析

虛擬去勢(shì)組原位移植瘤(LA1)、移植淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移瘤(LAN1)、去勢(shì)組第4代淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移瘤進(jìn)行體外培養(yǎng)(LBN 1)。三種細(xì)胞系分別置常規(guī)培養(yǎng)液(10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液)、低濃度血清培養(yǎng)液(3% FBS的RPMI1640培養(yǎng)液)及雄激素添加培養(yǎng)液(3% FBS的RPMI1640含1.0 nmol人工合成雄激素R1881)分別培養(yǎng)，顯示在常規(guī)培養(yǎng)液中與LA1相比，LAN1和LBN1細(xì)胞具有更高增殖能力，且更早進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期; 在低濃度血清培養(yǎng)液中LA1和LAN1細(xì)胞增殖能力相似, LBN1細(xì)胞具有明顯高的增殖能力; 而在雄激素添加培養(yǎng)液中三種細(xì)胞系顯示相似的細(xì)胞增殖能力, 提示LA1、LAN1、LBN1體外增殖能力不同, LA1、LAN1顯示激素依賴(lài)性生長(zhǎng)特性而LBN1細(xì)胞獲得雄激素抵抗生長(zhǎng)特性(圖3)。

2.4 細(xì)胞侵襲分析

Matrigel基質(zhì)膠具有模仿體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)的功能, 一定程度上反映細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲能力, 侵襲實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果顯示三種細(xì)胞系的侵襲指數(shù)分別為3.658%、4.135%和 7.201%，LBN1約為L(zhǎng)A1的兩倍。三種細(xì)胞系侵襲指數(shù)方差分析結(jié)果顯示LA1與LBN1差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.5 裸小鼠背部皮下移植瘤模型鑒定細(xì)胞系成瘤能力

LA1、LAN1和LBN1細(xì)胞系分別于裸小鼠背部皮下移植后28 d、28 d和22 d，可在移植部位觸摸到移植瘤。8周后解剖，可見(jiàn)腫瘤在局部皮下生長(zhǎng), 未見(jiàn)明顯浸潤(rùn), 未見(jiàn)肝肺轉(zhuǎn)移。組織學(xué)觀察顯示移植瘤細(xì)胞呈團(tuán)片狀生長(zhǎng)，局部可見(jiàn)腺管形成趨勢(shì), 免疫組化證實(shí)AR表達(dá)陽(yáng)性(圖4)。虛擬去勢(shì)裸小鼠皮下移植瘤腫瘤濕重三組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。去勢(shì)裸小鼠證實(shí)LA1、LAN1為雄激素依賴(lài)性生長(zhǎng),LBN1具有雄激素抵抗生長(zhǎng)特性。LBN1細(xì)胞在去勢(shì)和虛擬去勢(shì)鼠間腫瘤濕重?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。

圖 2 裸小鼠原代原位移植瘤Figure 2 The primary orthotopic transplanted tumor

圖 4 LBN1細(xì)胞裸小鼠異種移植瘤A: 組織學(xué)結(jié)構(gòu)(HE×200); B: AR免疫組化染色(×400)Figure 4 LBN1 subcutaneous transplanted tumorA: histological structure(HE×200); B: AR immunohistochemical staining(×400)

表 1 人源前列腺癌裸小鼠前列腺原位移植

A:常規(guī)培養(yǎng)液; B:低濃度血清培養(yǎng)液; C:和雄激素添加培養(yǎng)液圖 3 細(xì)胞增殖曲線A: common medium; B: low serum medium; C: androgen containing mediumFigure 3 The cell proliferation curve

表 2 三種細(xì)胞系在裸小鼠皮下移植瘤的形成

3 討論

腫瘤的轉(zhuǎn)移不僅與自身分泌的腫瘤因子有關(guān)，而且很大程度上取決于腫瘤胞與腫瘤微環(huán)境的相互作用來(lái)推動(dòng)分離的亞群細(xì)胞轉(zhuǎn)移[10]。如腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞可誘導(dǎo)腫瘤基質(zhì)降解，增強(qiáng)腫瘤遷移能力及血管形成能力。組織塊移植包含了腫瘤的所有成分，更能代表腫瘤的初始情況。本實(shí)驗(yàn)表明組織塊原位移植能夠穩(wěn)定傳代并發(fā)生轉(zhuǎn)移適用于研究腫瘤的進(jìn)展。

激素消融治療是轉(zhuǎn)移性前列腺癌的基礎(chǔ)治療手段，但大部分病人激素消融后發(fā)生雄激素抵抗，腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移導(dǎo)致病人死亡。當(dāng)前對(duì)于轉(zhuǎn)移性前列腺癌缺乏有效的治療手段，間接反映了對(duì)腫瘤進(jìn)展機(jī)制不了解[11]。前列腺癌轉(zhuǎn)移進(jìn)展機(jī)制的研究一直受阻于臨床相關(guān)的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，?dāng)前模型主要是通過(guò)購(gòu)買(mǎi)國(guó)外高度惡性細(xì)胞系，培養(yǎng)制成細(xì)胞懸液進(jìn)行皮下移植或者腎被膜注射移植誘發(fā)腫瘤模型[12]。這并不能確切反映國(guó)人前列腺癌的發(fā)生進(jìn)展過(guò)程。本課題采用國(guó)人前列腺癌組織塊原位移植方法分別移植到去勢(shì)組及虛擬去勢(shì)組裸小鼠并傳代篩選出生物學(xué)形狀不同的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行建模，目的在于探討如何能建立模擬人體內(nèi)腫瘤的進(jìn)展及分化的裸小鼠腫瘤模型，為研究腫瘤轉(zhuǎn)移進(jìn)展及激素抵抗發(fā)生機(jī)制奠定基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)組織塊原位移植能模擬腫瘤在人體內(nèi)的生長(zhǎng)情況，移植效果與文獻(xiàn)報(bào)道的細(xì)胞懸液原位注射以及組織塊腎被膜移植等方法對(duì)比，人前列腺癌組織塊原位移植具有較高的成瘤率，與腫瘤生長(zhǎng)初始環(huán)境及微環(huán)境對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)及調(diào)控自我分化有重大影響這一理論吻合。我們嘗試了用病人組織塊制備未經(jīng)篩選的混合細(xì)胞懸液，參考李志玲等[13]前列腺癌原位模型建立方法，采用注射移植方式移植到前列腺及精囊腺部，未能取得滿意效果。精囊腺質(zhì)地較脆、前列腺被膜緊張，細(xì)胞懸液易滲出流入腹腔可能造成人為性轉(zhuǎn)移。組織塊原位移植的缺點(diǎn)在于操作要求較高，雖然采用眼科手術(shù)器械操作，但由于裸小鼠前列腺體積較小能移植的組織塊較小，而且會(huì)損傷組織塊及宿主臟器影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

經(jīng)過(guò)不間斷的傳代移植, 腫瘤成瘤率以及轉(zhuǎn)移能力等惡性潛能逐漸增強(qiáng), 繼而從虛擬去勢(shì)裸小鼠淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌獲得激素非依賴(lài)性質(zhì)并在去勢(shì)裸小鼠第4代傳代移植中出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。選取具有不同生物學(xué)性狀的初代虛擬去勢(shì)裸小鼠原位移植瘤、初代虛擬去勢(shì)裸小鼠淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移瘤以及初代去勢(shì)裸小鼠淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移瘤作為不同惡性潛能的代表建立的細(xì)胞系證實(shí)三種細(xì)胞在增殖、遷移、激素依賴(lài)等性能上存在顯著性差別。為進(jìn)一步研究中國(guó)人前列腺癌的發(fā)展以及激素抵抗發(fā)生機(jī)制提供了的良好模型。

綜上所述: 采用組織塊裸小鼠前列腺原位外科移植可模擬腫瘤在人體內(nèi)的生長(zhǎng)環(huán)境建立裸小鼠前列腺癌異種原位移植模型；裸小鼠前列腺癌原位移植反復(fù)傳代可增強(qiáng)腫瘤成瘤率、轉(zhuǎn)移力等惡性指標(biāo)；以裸小鼠淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移瘤接種去勢(shì)裸小鼠可篩選出激素非依賴(lài)性異種移植瘤及轉(zhuǎn)移瘤。為進(jìn)一步研究中國(guó)人前列腺癌的發(fā)展以及激素抵抗發(fā)生機(jī)制提供了的良好模型。

[1] 儲(chǔ)劍虹, 孫祖越. 人前列腺癌移植性轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型的研究進(jìn)展[J].實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué), 2005, 25(2):119-125.

[2] Leav I, Schelling KH, Adams JY, et al. Role of canine basal cells in prostatic post natal development, induction of hyperplasia, sex hormone-stimulated growth; and the ductal origin of carcinoma[J]. Prostate, 2001, 47(3):149-163.

[3] Kasper S. Survey of genetically engineered mouse models for prostate cancer: analyzing the molecular basis of prostate cancer development, progression, and metastasis[J]. J Cell Biochem, 2005, 94(2):279-297.

[4] Nguewa PA, Calvo A. Use of transgenic mice as models for prostate cancer chemoprevention[J]. Curr Mol Med, 2010,10(8):705-718.

[5] Kerkhofs S, Denayer S, Haelens A, et al. Androgen receptor knockout and knock-in mouse models[J]. J Mol Endocrinol,2009, 42(1):11-17.

[6] Cotroneo MS, Haag JD, Zan Y, et al. Characterizing a rat Brca2 knockout model[J]. Oncogene, 2007, 26(11):1626-1635.

[7] Maini A, Archer C, Wang CY, et al. Comparative pathology of benigh prostate hyperplasia and prostate cancer[J], In Vivo, 1997, 11:293-299.

[8] Pylkkanen L, Mkela S, Santti R. Animal models for the preneoplastic lessons of the prostate[J]. Eur Urol, 1996, 30:243-248.

[9] 王元天, 孫穎浩, 邱鎮(zhèn), 等. 人類(lèi)前列腺癌裸小鼠原位移植瘤模型的建立[J]. 中華泌尿外科雜志, 2005, 26(3):208-209.

[10] Fidler IJ. The pathogenesis of cancer metastasis: the ‘seed and soil’ hypothesis revisited[J]. Nat Rev Cancer, 2003, 3:453-458.

[11] Huggins C and Hodges CV. Studies on prostatic cancer: The effects of castration, of estrogen and of androgen injection on serum phosphatases in metastaic carcinoma of the prostate[J]. Cancer Res, 1941, 1:293-297.

[12] Pfitzenmaier J, Quinn JE, Odman AM, et al. Characterization of C4-2 prostate cancer bone metastases and their response to castration[J]. J Bone Miner Res, 2003, 18:1882-1888.

[13] 李志玲, 劉向云, 張曉芳, 等. 不同細(xì)胞株建立人前列腺癌裸小鼠移植模型及轉(zhuǎn)移特性比較[J]. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué)雜志, 2006, 26(4):207-212.

Establishment of Different Malignant Potential Prostate Cancer Animal Model from Same Origination

ZHANG Zhen-hua2, SHEN Zeng-li2, HOU Chuan-ling1, SONG Chun-jiao1, SUN Ai-jing1
(1. Department of Pathology, Shaoxing People's Hospital & Shaoxing Hospital of Zhejiang University,Shaoxing 312000, China; 2. Department of Pathology, The First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou 325000, China)

ObjectiveSupplying ideal animal model for investigating the mechanism of tumor progress and hormone resistant in prostate cancer.MethodsProstate cancer tissue was obtain via prostatectomy and cut into specimens which orthotopic transplanted into castrate group and shamcastration group nude mice .T hen tumor was harvest and transplant to next generation. until emergence of lymph node metastasis in two groups.. The cell growth curve of cell lines is used to evaluate their growth condition. Boyden chamber is used to evaluate metastasis ability of cell lines. The rate of tumor formation, weight of tumor and range of tumor infiltration of three cell lines was confirmed by subcutaneous transplant.ResultThe tumorgenic in sham-castration group is 30% without lymph node metastasis in first generation, after three passages is 50%, lymph node metastasis in pelvic is 40%. In castrate group, no tumor formation and lymph node metastasis in first generation. One pelvic lymph node metastasis is find after the forth passages which tumor origin from the lymph node metastasis of shamcastration group.. There are significant differences of cell proliferation transfer ability and tumor rate in vitro and vivo between three cell lines. (p＜0.05).ConclusionIt’s feasible that applying surgical specimens of prostate cancer to establishment .nude mice orthotopic graft model. It is possible to screen heterotransplant tumors and metastasis tumors without hormone dependency by graft rat’s lymph node metastasis tumor into castrate nude mice.

Prostate cancer; Orthotopic xenotransplantation; Tumor model; Androgen resistance

Q95-33

A

1674-5817(2014)02-0083-06

10.3969/j.issn.1674-5817.2014.02.001

2013-09-23

浙江省醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)計(jì)劃(GJSX-010-004); 浙江省公益性技術(shù)應(yīng)用研究計(jì)劃項(xiàng)目(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物2011C37081); 浙江省自然科學(xué)研究基金(Y13H160104)

張振華(1986-), 男, 碩士, 醫(yī)師,E-mail: zzhsg2005@163.com

孫愛(ài)靜(1963-), 女, 醫(yī)學(xué)博士, 教授, 從事實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)研究和腫瘤病理學(xué)研究,E-mail: sun_aijing@hotmail.co.jp