盧光新, 呂 飛, 杜 勇, 楊艷果, 周春芳, 金靈莉, 楊建業(yè)

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬十堰市人民醫(yī)院1. 消化內(nèi)科; 2. 臨床研究所, 十堰市 442000)

復(fù)方甘草酸苷對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸組織NF-κB p65及COX-2表達(dá)的影響

盧光新1, 呂 飛1, 杜 勇1, 楊艷果1, 周春芳1, 金靈莉1, 楊建業(yè)2

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬十堰市人民醫(yī)院1. 消化內(nèi)科; 2. 臨床研究所, 十堰市 442000)

目的 觀察復(fù)方甘草酸苷對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠核因子-κB p65(NF-κB p65)及環(huán)氧合酶2(COX-2)的影響并探討其作用機(jī)制。方法 成年SD大鼠40只, 隨機(jī)分成4組, 即正常對(duì)照組、模型組、復(fù)方甘草酸苷治療組及柳氮磺胺吡啶(SASP)治療組。正常對(duì)照組不做任何處理，其余3組用2.5%三硝基苯磺酸鈉/乙醇溶液灌腸制備潰瘍性結(jié)腸炎模型，模型組用生理鹽水灌腸3 d后處死，復(fù)方甘草酸苷治療組每日用復(fù)方甘草酸苷溶液(40 mg/kg)連續(xù)灌腸7 d后處死; SASP治療組每日用SASP溶液(0.5 g/kg)連續(xù)灌腸7 d后處死。經(jīng)不同處理和治療后，運(yùn)用免疫組化染色(SABC法)檢測(cè)NF-κB p65 及 COX-2表達(dá)。結(jié)果 與正常對(duì)照組相比，模型組、復(fù)方甘草酸苷治療組及SASP治療組的NF-κB p65表達(dá)水平明顯上升(P＜0.01); COX-2的表達(dá)水平亦明顯上升(P＜0.01);與模型組相比，復(fù)方甘草酸苷組及SASP治療組的NF-κB p65、COX-2的表達(dá)水平均明顯下降(P＜0.01)。結(jié)論 復(fù)方甘草酸苷對(duì)大鼠潰瘍性結(jié)腸炎有良好的治療作用，其作用機(jī)制可能與降低大鼠結(jié)腸組織中NF-κB p65 及 COX-2的表達(dá)有關(guān)。

潰瘍性結(jié)腸炎(UC); 三硝基苯磺酸 /乙醇; 復(fù)方甘草酸苷; 核因子 -κB p65(NF-κB p65);環(huán)氧合酶2(COX-2)

迄今為止，潰瘍性結(jié)腸炎(UC)的特異性致病因素和發(fā)病機(jī)制仍無(wú)準(zhǔn)確定論，大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為UC的發(fā)生是免疫、遺傳、環(huán)境及腸道細(xì)菌等多種因素共同作用的結(jié)果。近年來(lái)多項(xiàng)研究證實(shí)，免疫反應(yīng)的異常是造成UC炎癥和組織損傷的內(nèi)在重要因素。而細(xì)胞因子則在介導(dǎo)這一異常的免疫反應(yīng)中起重要作用，腸道細(xì)胞因子表達(dá)異常是 UC發(fā)病的重要機(jī)制之一[1～2]。核因子 -κB(NF-κB)可促進(jìn)多種炎性細(xì)胞因子，如IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、TNF-α等基因的轉(zhuǎn)錄[3]。NF-κB家族由5個(gè)成員組成, 其中p65具有顯著的促炎特性, 在調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄中起著關(guān)鍵性的作用, 所以, NF-κB活化可能是UC發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵點(diǎn)。而環(huán)氧合酶2(COX-2)作為炎癥反應(yīng)中的主要誘導(dǎo)酶，其在UC發(fā)病中的作用日益受到重視，國(guó)外臨床及實(shí)驗(yàn)研究表明COX-2在該炎癥發(fā)展過(guò)程中起重要作用[4]。作者前期研究采用復(fù)方甘草酸苷治療UC取得明顯療效，為了探討其作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)主要研究復(fù)方甘草酸苷對(duì)UC大鼠NF-κB p65及COX-2的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠40只, 雌雄各半, 分籠飼養(yǎng), 體質(zhì)量180～220 g，由湖北醫(yī)藥學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供[SCXK(鄂)2011-0008]。飼養(yǎng)于SPF動(dòng)物設(shè)施。

1.2 主要試劑與儀器

兔抗大鼠 NF-κB p65(Sigma-AldrichChemical Co);免疫組化試劑盒由博士得生物工程有限公司生產(chǎn)，批號(hào): DEC 022005; 乙二胺四乙酸(EDTA) 抗原修復(fù)液 (用蒸餾水稀釋后使用)，由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，批號(hào): 501101; SFC-18型生物顯微鏡由廈門麥克奧迪公司生產(chǎn); 3K-30Z型高速冷凍離心機(jī)由Sigma公司生產(chǎn); A5002型酶標(biāo)儀由Tecan公司生產(chǎn)。

復(fù)方甘草酸苷主要中藥成分是甘草, 有效作用成分為甘草提取物甘草酸苷，其化學(xué)結(jié)構(gòu)類似于皮質(zhì)激素，溶液制備方法: 將80 mg復(fù)方甘草酸苷粉劑溶于100 ml鹽水中，按每日40 mg/kg劑量灌腸。

1.3 UC 模型的建立及處理

[5]，大鼠禁食24 h(不禁水)，隨機(jī)分4組，A組為正常對(duì)照組; B、C、D組造模采用2.5%TNBS/乙醇(V/V)溶液灌腸, 1.0 ml/200 g體質(zhì)量, 戊巴比妥鈉30 mg/ kg腹腔麻醉后, 用聚乙烯導(dǎo)管插入大鼠結(jié)腸內(nèi)距肛門口8 cm處，然后用注射器注入上述灌腸液, 并將大鼠倒置1 min。24 h后, B組模型對(duì)照組采用生理鹽水灌腸, 1.0 ml/200 g體質(zhì)量，連續(xù)灌腸3 d后處死取材；C組每日用復(fù)方甘草酸苷溶液(40 mg/kg)，連續(xù)灌腸7 d后處死取材; D組每日用SASP溶液(0.5 g/kg)，連續(xù)灌腸7 d后處死取材。

模型成功標(biāo)準(zhǔn)如下，①全身癥狀: 大鼠毛色無(wú)華、變脆、嗜臥扎堆，并出現(xiàn)懶動(dòng)、拱背，體重下降; ②消化道癥狀: 厭食，大便次數(shù)增多，大便末端有粘液或膿血點(diǎn)等表現(xiàn); ③隨機(jī)處死UC模型大鼠，取結(jié)腸組織予以評(píng)分，并在光鏡下觀察病理情況: 病變結(jié)腸粘膜充血水腫、上皮脫落、壞死、潰瘍形成、粘膜下層有大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、有隱窩膿腫形成

1.4 標(biāo)本處理

4組大鼠予以相應(yīng)處理后，用脫頸法處死，腹主動(dòng)脈采血后，解剖大鼠，選擇結(jié)腸病變最嚴(yán)重的部位剪取2.0 cm，放入體積分?jǐn)?shù)10%中性緩沖福爾馬林溶液中固定。

1.5 免疫組織化學(xué)檢測(cè)步驟

切片常規(guī)脫蠟至水。體積分?jǐn)?shù)30%H2O21份+蒸餾水9份混合, 室溫10 min以滅活內(nèi)源性酶。蒸餾水洗3次。熱修復(fù)抗原: 將切片浸入0.02 mol/LPBS緩沖溶液(pH7.2～7.6), 微波爐加熱至沸騰后斷電, 保持溫度5～10 min后, 室溫放置。冷卻后滴加體積分?jǐn)?shù)5%BSA封閉液, 37℃恒溫箱反應(yīng)30 min。甩去多余液體, 不洗。滴加抗體稀釋液稀釋的一抗(稀釋度1∶75), 4℃過(guò)夜。PBS(pH7.2～7.6)洗20 min×2次。滴加生物素化山羊抗兔IgG, 37℃ 30 min。PBS(pH7.2～7.6)洗20 min×2次。滴加試劑SABC，37℃ 30 min。PBS(pH7.2～7.6)洗30 min×3次。DAB顯色:使用DAB顯色試劑盒(AR1022)。取1 ml蒸餾水，加試劑盒中A、B、C試劑各1滴，混勻后加至切片。室溫顯色，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間。也可自配顯色劑顯色。蒸餾水洗滌。蘇木素輕度復(fù)染。脫水，透明，封片。顯微鏡觀察。

1.6 判定方法[6]

采用半定量積分法計(jì)算免疫組織化學(xué)染色積分, 即分別對(duì)每張切片的陽(yáng)性細(xì)胞及陽(yáng)性細(xì)胞著色程度進(jìn)行分級(jí)記分, 結(jié)果以兩項(xiàng)之和表示 陽(yáng)性細(xì)胞率:每張切片檢測(cè)5個(gè)視野(400倍)，所見(jiàn)的陽(yáng)性細(xì)胞分為0～4 級(jí)(共5級(jí)) 0級(jí)為陰性，記0分; 1級(jí)陽(yáng)性細(xì)胞占1%～25% 記1分; 2級(jí)陽(yáng)性細(xì)胞占 26% ～50% 記 2 分; 3 級(jí)陽(yáng)性細(xì)胞占 51% ～ 75% 記 3 分;4 級(jí)陽(yáng)性細(xì)胞占 76%～100%記4 分。染色強(qiáng)度:顯微鏡下觀察, 僅細(xì)胞核著藍(lán)色者為陰性，細(xì)胞質(zhì)或核膜上呈棕黃色為陽(yáng)性 強(qiáng)度分0～ 3 級(jí) (共4 級(jí))0 級(jí)為陰性記0 分; 1 級(jí)為弱陽(yáng)性染色記1 分; 2 級(jí)為陽(yáng)性染色記 2 分; 3 級(jí)為強(qiáng)陽(yáng)性染色記3 分。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 NF-κB p65的表達(dá)

正常對(duì)照組NF-κB p65呈弱表達(dá)，模型組結(jié)腸組織NF-κB p65的表達(dá)明顯高于正常對(duì)照組，對(duì)比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05); 復(fù)方甘草酸苷治療組與SASP治療組結(jié)腸組織NF-κB p65表達(dá)高于正常對(duì)照組 (P＜0.05), 復(fù)方甘草酸苷治療組結(jié)腸組織NF-κB p65表達(dá)與SASP治療比較無(wú)明顯差別 (P＞0.05)(表1)。

2.2 COX-2的表達(dá)

正常對(duì)照組COX-2呈弱表達(dá), 模型組結(jié)腸組織COX-2的表達(dá)明顯高于正常對(duì)照組, 對(duì)比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05); 復(fù)方甘草酸苷治療組與SASP 組結(jié)腸組織COX-2表達(dá)高于正常對(duì)照組, 對(duì)比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05), 復(fù)方甘草酸苷治療組結(jié)腸組織COX-2表達(dá)與SASP治療組比較無(wú)明顯差別 (P＞0.05)(表2)。

表 1 各組大鼠結(jié)腸組織NF-κB p65表達(dá)情況

表 2 各組大鼠結(jié)腸組織COX-2表達(dá)情況

3 討論

UC是一種腸道慢性非特異性炎癥，雖然其發(fā)病機(jī)制尚不明確，但是細(xì)胞因子在UC發(fā)病中的作用已得到公認(rèn)。近年研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB調(diào)控著UC患者細(xì)胞因子的釋放，從而參與了UC腸道的炎癥和免疫反應(yīng)，提示NF-κB與 UC發(fā)病關(guān)系密切[7]。NF-κB是高度保守的一種轉(zhuǎn)錄因子，廣泛存在于各種組織中，NF-κB是一種能與免疫球蛋白輕鏈基因的增強(qiáng)子B序列(GGGACTTTCC) 特異性結(jié)合的核蛋白，廣泛存在于各種組織中，能與許多細(xì)胞基因的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子中的闎轉(zhuǎn)錄序列位發(fā)生特異性結(jié)合, 在免疫和炎癥反應(yīng)、細(xì)胞生長(zhǎng)、病毒感染及某些疾病急性期反應(yīng)等方面起著重要作用。NF-κB可以調(diào)控任何含有B位點(diǎn)的基因轉(zhuǎn)錄，包括細(xì)胞因子及其受體(IL-1、IL-6，IL-8，TNF-α，IL-2R)粘附分子(ICAM-1，VCAM-1)促進(jìn)或抑制凋亡蛋白(Bcl-xL，F(xiàn)sa，F(xiàn)asL) 急性期反應(yīng)蛋白(CRP) 趨化因子(RANTFS，MCP，MTP) 補(bǔ)體、生長(zhǎng)因子、酶分子、轉(zhuǎn)錄因子等，釋放的細(xì)胞因子又可反過(guò)來(lái)進(jìn)一步活化NF-κB，由此形成一個(gè)正反饋調(diào)節(jié)，使炎癥不斷放大[8]。

環(huán)氧化酶(cyclooxygenase, COX)至少存在兩種異構(gòu)體，即環(huán)氧化酶-1(COX-1)和環(huán)氧化酶-2(COX-2)。COX-2是在各種刺激因子作用下激活表達(dá)的誘導(dǎo)酶[9]，COX-2的高表達(dá)可促進(jìn)花生四烯酸的代謝，復(fù)方甘草酸苷主要有效成分為甘草酸苷，其化學(xué)結(jié)構(gòu)類似于皮質(zhì)激素，具有抗炎、抗過(guò)敏的作用，可以直接與花生四烯酸代謝途徑的啟動(dòng)酶磷脂酶A2結(jié)合，還可以與作用于花生四烯酸，使其產(chǎn)生炎性介質(zhì)的脂氧合酶結(jié)合，選擇性地阻礙這些酶的磷酸化而抑制其活化，減少炎性介質(zhì)的產(chǎn)生。本實(shí)驗(yàn)復(fù)方甘草酸苷治療組中COX-2的表達(dá)水平較模型組明顯降低(P＜0.05)，說(shuō)明復(fù)方甘草酸苷能夠抑制結(jié)腸組織COX-2的表達(dá), 從而起到抑制炎癥, 修復(fù)潰瘍的作用。COX-2啟動(dòng)子含有NF-κB的結(jié)合位點(diǎn)[11], 故NF-κB亦能夠?qū)OX-2的表達(dá)起調(diào)控作用，因此，NF-κB在UC的病理生理過(guò)程中可能起樞紐作用，而NF-κB p65是NF-κB家族5個(gè)成員之一, 是炎癥性腸病中最重要的促炎單位[12]。

本研究發(fā)現(xiàn)大鼠實(shí)驗(yàn)性UC模型中NF-κB p65、COX-2的表達(dá)明顯增高，通過(guò)藥物干預(yù)發(fā)現(xiàn)，復(fù)方甘草酸苷治療組中NF-κB p65、COX-2的表達(dá)水平較模型組明顯降低(P＜0.05)，說(shuō)明復(fù)方甘草酸苷能夠抑制結(jié)腸組織NF-κB、COX-2的表達(dá)，從而起到抑制炎癥, 修復(fù)潰瘍的作用, NF-κB信號(hào)途徑調(diào)控許多靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，包含復(fù)雜的靶效應(yīng)，COX-2 基因只是NF-κB的下游基因之一，故推測(cè)其治療UC的作用機(jī)制可能是通過(guò)抑制NF-κB的活化, 抑制了NF-κB與DNA結(jié)合, 進(jìn)而進(jìn)一步降低了炎癥因子及COX-2的表達(dá), 從而起到抑制炎癥反應(yīng)及調(diào)節(jié)免疫，在腸黏膜局部通過(guò)抑制可以增強(qiáng)COX-2表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子, 或者減少炎癥因子對(duì)COX-2的刺激作用, 從而減少COX-2的表達(dá), 進(jìn)而減少前列腺素類炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生, 緩解腸道病變。

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Effect of Compound Glycyrrhizin on Expressions of Colonic NF-κB p65 and COX-2 in Ulcerative Colitis Rats

LU Guang-xin1, LV Fei1, DU Yong1, YANG Yang-guo1, ZHOU Chun-fang1, JIN ling-li1, YANG Jian-ye2
(1. Department of Gastroenterology, 2. Clinical Research Institute,Renmin Hospital, Hubei University of Medicine, Shiyan 442000, China)

ObjectiveTo investigate the experimental therapeutic effect of the Compound Glycyrrhizin on the expression of NF-κB p65 and COX-2 in rats with ulcerative colitis(UC) induced by trinitrobenzene sulfonic acid/ethanol (TNBS/ethanol).MethodsForty adult Sprague-Dawley rats were randomly divided into 4 groups(n=10), Normal control group received no treatment, while the rest groups used trinitrobenzene sulfonic acid/ethanol enema to generate ulcerative colitis models. UC model group received saline water enema and decapitated three days later, Compound glycyrrhizin glycosides treatment group daily received glycyrrhizin glycosides solution enema, 40 mg·kg-1·d-1, Continuous enema 7 days and decapitated,, Sulfasalazine (SASP) treatment group daily received SASP solution enema,0.5 g·kg-1·d-1, Continuous enema 7 days and decapitated, Each group received different treatment as described above, NF-κB p65 and COX-2 were detected by immunohistochemistry.ResultsCompared with Normal control group, the level of NF-κB p65 was significantly increased in UC model group、SASP treatment group and Compound glycyrrhizin glycosides treatment group [0.25±0.11 vs 5.58±0.85 vs 3.36±0.66 vs 3.21±0.58, P＜0.01], and the level of COX-2 was significantly increased [0.21±0.13 vs 5.54±0.40 vs 3.23±1.05 vs 3.16±0.94, P＜0.01]. Compared with Model group, the level of NF-?B p65 was significantly decreased in SASP treatment group and Compound glycyrrhizin glycosides treatment group [5.58±0.85 vs 3.36±0.66 vs 3.21±0.58, P＜0.01], and the level of COX-2 was significantly decreased [5.54±0.40 vs 3.23±1.05 vs 3.16±0.94, P＜0.01].ConclusionCompound Glycyrrhizin has therapeutic effect on ulcerative colitis in rat. The mechanism is associated with the reduced levels of NF-κB p65 and COX-2.

Ulcerative colitis; Rats; Trinitrobenzenesulfonic acid/ethanol; Compound Glycyrrhizin;NF-κB p65; COX-2

R574.62 Q95-33

A

1674-5817(2014)02-0098-04

10.3969/j.issn.1674-5817.2014.02.004

2013-08-14

湖北省教育廳科學(xué)技術(shù)研究計(jì)劃指導(dǎo)性項(xiàng)目(B類: 10026122)

盧光新(1969-), 男, 碩士, 主任醫(yī)師, 研究方向: 中西醫(yī)結(jié)合治療消化系統(tǒng)疾病,E-mail: sylgx1325@sina.com

呂 飛(1983-), 男, 碩士, 住院醫(yī)師, 研究方向: 中西醫(yī)結(jié)合治療消化系統(tǒng)疾病,E-mail: 276699533@qq.com