唐霄雯，陽(yáng)婭玲，高應(yīng)龍，肖紅利，何哲耘，鄭靜，3，鄭斌嬌，呂建新，金龍金，管敏鑫，3

（1.溫州醫(yī)科大學(xué) Attardi線(xiàn)粒體生物醫(yī)學(xué)研究院，浙江 溫州 325035；2.溫州醫(yī)科大學(xué) 仁濟(jì)學(xué)院，浙江 溫州 325035；3.浙江大學(xué) 遺傳研究所，浙江 杭州 310058）

耳聾是人類(lèi)感覺(jué)系統(tǒng)障礙最常見(jiàn)的疾病之一。50%以上的耳聾是由遺傳因素造成的，遺傳方式包括常染色體顯性遺傳、常染色體隱性遺傳、X-連鎖以及母系遺傳等[1-2]。線(xiàn)粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）突變是母系遺傳性耳聾重要的分子遺傳基礎(chǔ)。目前與氨基糖甙類(lèi)（aminoglycoside antibiotics，AmAn）藥物性耳聾和非綜合征型耳聾密切相關(guān)的mtDNA突變主要集中在線(xiàn)粒體12S rRNA和tRNASer(UCN)基因上[3-5]。其中位于線(xiàn)粒體12S rRNA上的A1555G和C1494T突變分別導(dǎo)致新的G-C和A-U堿基配對(duì)的形成，在線(xiàn)粒體12S rRNA上形成一個(gè)與AmAn結(jié)合的位點(diǎn)，使該類(lèi)藥物更容易結(jié)合到線(xiàn)粒體12S rRNA上，從而導(dǎo)致耳聾的發(fā)生[6-7]。而位于線(xiàn)粒體tRNASer(UCN)基因上的A7445G、A7445C、G7444A、7472insC、T7510C和T7511C突變?cè)诠δ苌弦呀?jīng)被證明與非綜合征型耳聾發(fā)病相關(guān)[8-13]。本研究將對(duì)已收集的以及新發(fā)現(xiàn)的11個(gè)攜帶線(xiàn)粒體tRNASer(UCN)G7444A突變的中國(guó)漢族母系遺傳非綜合征型耳聾家系從臨床、家系和分子遺傳學(xué)等角度進(jìn)行詳細(xì)的評(píng)估和分析。

1 對(duì)象和方法

1.1 研究對(duì)象 選取2003年4月-2013年12月本課題組收集的中國(guó)漢族非綜合征型耳聾患者樣本2 650例。所有患者的臨床資料以及外周血樣采集均依據(jù)溫州醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)管理規(guī)定執(zhí)行。經(jīng)溫州、寧波地區(qū)4家醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科門(mén)診進(jìn)行詳細(xì)的發(fā)病史調(diào)查和體格檢查，確定患者是否具有其他臨床疾病表型，是否有AmAn使用史，以及是否有噪聲接觸史等其他致聾因素。

1.2 聽(tīng)力學(xué)檢查 聽(tīng)力學(xué)檢查主要包括純音測(cè)聽(tīng)（pure tone audiometry，PTA）、聽(tīng)覺(jué)腦干反應(yīng)（auditory brainstem response，ABR）、聲阻抗以及畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射（distortion product otoacoustic，DPOAE）。以聽(tīng)力水平的分貝（dB）值為單位記錄PTA結(jié)果，并以頻率500、1 000、2 000、4 000和8 000 Hz的聽(tīng)閾平均值計(jì)算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)患者聽(tīng)力損失程度進(jìn)行分類(lèi)，分5級(jí)：正常≤25 dB，輕度聾=26～40 dB，中度聾=4l～70 dB，重度聾=71～90 dB和極重度聾＞90 dB。PTA的聽(tīng)力曲線(xiàn)類(lèi)型分為斜坡型（slope）：聽(tīng)力損失主要以2 000～8 000 Hz為主，患者聽(tīng)力閾值水平隨測(cè)試頻率的升高而逐漸升高；平坦型（flat）：也稱(chēng)全頻聽(tīng)力下降型曲線(xiàn)，患者各聲音頻率的聽(tīng)力水平基本一致；上升型（rising）：患者的低頻聽(tīng)力250～1 000 Hz較差，隨測(cè)試頻率的升高聽(tīng)力閾值逐漸降低；谷型（valley）：聽(tīng)力損失以500～2 000 Hz為主；切跡型（notched）：僅單一頻率處閾值明顯升高，相鄰頻率正?；蚪咏谡＃簧叫停╮idge）：中間頻率閾值比兩端至少低20 dB。

1.3 耳聾相關(guān)熱點(diǎn)基因突變檢測(cè)

1.3.1 全基因組DNA提?。菏紫瘸槿《@患者外周靜脈血2～3 mL（EDTA抗凝），使用DNA提取試劑盒（Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.4.0）提取全基因組DNA，-20 ℃保存。嬰幼兒可采用三菱針針刺患兒耳垂、足底或手指，濾紙吸取2～3滴靜脈血后使用酚氯仿手工法提取全基因組DNA[14]，-20 ℃保存。

1.3.2 耳聾相關(guān)熱點(diǎn)基因突變檢測(cè)：以提取的全基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增耳聾患者的線(xiàn)粒體12S rRNA、tRNASer(UCN)基因以及GJB2基因編碼區(qū)[15-16]，相應(yīng)PCR擴(kuò)增信息及測(cè)序峰圖如表1和圖1所示。

PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后送華大基因測(cè)序公司進(jìn)行雙向測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與校正的劍橋標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對(duì)[17]，以確定是否含有耳聾相關(guān)熱點(diǎn)基因突變。

2 結(jié)果

2.1 先證者臨床資料分析 新發(fā)現(xiàn)的4個(gè)攜帶線(xiàn)粒體tRNASer(UCN)G7444A突變家系如圖2所示。NB133家系，先證者（II-3），男，24歲，2歲時(shí)因感冒靜脈注射AmAn抗感染1 d，1個(gè)月后發(fā)現(xiàn)雙側(cè)聽(tīng)力下降，用藥前說(shuō)話(huà)正常。先證者的兩個(gè)哥哥均表現(xiàn)為中度耳聾，大哥（II-4），42歲，有慶大霉素、新霉素用藥史，右耳聽(tīng)閾55 dB，左耳聽(tīng)閾53 dB；二哥（II-6），39歲，右耳聽(tīng)閾52 dB，左耳聽(tīng)閾62 dB，聽(tīng)力曲線(xiàn)均為斜坡型。家系其他成員無(wú)AmAn用藥史且聽(tīng)力正常。NB148家系，先證者（III-2），男，19歲，先天性耳聾，7～8個(gè)月時(shí)有用藥史（具體用藥不詳)，用藥后逐漸出現(xiàn)聽(tīng)力下降。先證者弟弟（III-1），男，16歲，1個(gè)月時(shí)發(fā)現(xiàn)聽(tīng)力損失，右耳聽(tīng)閾113 dB，左耳聽(tīng)閾110 dB，聽(tīng)力曲線(xiàn)為斜坡型。家系其他成員聽(tīng)力正常。WLT024家系，先證者（III-2），女，13歲，無(wú)明確用藥史，1歲時(shí)發(fā)現(xiàn)聽(tīng)力不好，測(cè)聽(tīng)發(fā)現(xiàn)極重度聽(tīng)力下降。右耳聽(tīng)閾110 dB，左耳聽(tīng)閾115 dB，聽(tīng)力曲線(xiàn)為平坦型。先證者表弟（III-10），男，7歲，先天性耳聾。WLT122家系，先證者（III-1），女，4歲，出生時(shí)對(duì)聲音有反應(yīng)，2歲時(shí)無(wú)誘因出現(xiàn)聽(tīng)力下降，否認(rèn)AmAn用藥史。右耳聽(tīng)閾108 dB，左耳聽(tīng)閾106 dB。先證者表弟（III-3）先天性耳聾，其母親懷孕7個(gè)月時(shí)白帶檢驗(yàn)支原體陽(yáng)性，醫(yī)生曾告誡孩子出生后可能為聾啞兒。其他7個(gè)家系先證者及母系成員詳細(xì)臨床資料見(jiàn)楊?lèi)?ài)芬等[18]和Jin等[19]報(bào)道。

表1 線(xiàn)粒體12S rRNA、tRNASer(UCN) 基因以及GJB2基因編碼區(qū)擴(kuò)增信息

圖1 線(xiàn)粒體tRNASer(UCN)基因G7444A突變測(cè)序峰圖

圖2 4個(gè)攜帶線(xiàn)粒體tRNASer(UCN) G7444A突變的耳聾家系圖

攜帶線(xiàn)粒體tRNASer(UCN)G7444A基因突變非綜合征型耳聾家系11個(gè)先證者（見(jiàn)表2），男7個(gè)，女4個(gè)，測(cè)聽(tīng)年齡4～24歲不等，發(fā)病年齡均在嬰幼兒時(shí)期（＜3歲）。其中3例無(wú)AmAn用藥史，11例患者均表現(xiàn)為雙耳對(duì)稱(chēng)性聽(tīng)力下降，聽(tīng)力下降水平均為重度及以上。聽(tīng)閾以高頻下降為主，PTA聽(tīng)閾曲線(xiàn)以斜坡型居多。

表2 11個(gè)攜帶線(xiàn)粒體tRNASer(UCN) G7444A基因突變家系先證者臨床資料

2.2 耳聾相關(guān)突變熱點(diǎn)分析 線(xiàn)粒體tRNASer(UCN)G7444A突變與非綜合征型耳聾相關(guān)[10]。該突變?cè)斐删€(xiàn)粒體重鏈上COI基因終止密碼子AGA改變?yōu)锳AA，導(dǎo)致COI基因翻譯出的多肽在羧基末端增加了3個(gè)氨基酸殘基（Lys、Gln和Lys）。同時(shí)，線(xiàn)粒體tRNASer(UCN)G7444A位點(diǎn)臨近輕鏈上tRNASer(UCN)前體3’端核酸外切酶的作用位點(diǎn)（見(jiàn)圖3）[9，12-13，20]，而且線(xiàn)粒體tRNA初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物3’端多余核苷酸需在核酸外切酶的作用下從末端逐個(gè)切除[21]，因此，線(xiàn)粒體tRNASer(UCN)G7444A突變可能影響tRNASer(UCN)的加工修飾。Guan等[22-23]發(fā)現(xiàn)tRNASer(UCN)前體上A7445G突變可造成tRNASer(UCN)前體加工缺陷，從而導(dǎo)致tRNASer(UCN)穩(wěn)定性和ND6 mRNA量的明顯下降。而線(xiàn)粒體tRNASer(UCN)7444位點(diǎn)與7445位點(diǎn)位置相鄰，可能通過(guò)相似機(jī)制影響線(xiàn)粒體功能。

圖3 人類(lèi)線(xiàn)粒體tRNASer(UCN)二級(jí)結(jié)構(gòu)圖

本研究對(duì)收集的2 650例中國(guó)漢族非綜合征型耳聾樣本進(jìn)行耳聾相關(guān)突變熱點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)，其中14例攜帶線(xiàn)粒體tRNASer(UCN)G7444A突變，突變率為0.5%。在僅攜帶線(xiàn)粒體tRNASer(UCN)G7444A突變的LS40、RA119、HA186和HA115 4個(gè)家系中，考慮AmAn用藥史的情況下，外顯率分別為9%、37.5%、13.3%、6.7%；不考慮AmAn用藥史的情況下外顯率分別為0、25%、7.7%、0。表明線(xiàn)粒體tRNASer(UCN)G7444A突變可能在AmAn性耳聾中發(fā)揮一定的作用。這11個(gè)中國(guó)漢族非綜合征型耳聾家系母系成員在聽(tīng)力損失嚴(yán)重程度、發(fā)病年齡以及耳聾外顯率方面存在較大差異，推測(cè)除線(xiàn)粒體tRNASer(UCN)G7444A突變?cè)谶@些家系中發(fā)揮作用外，可能其他因素如核基因和線(xiàn)粒體背景等因素也發(fā)揮一定的作用。在11個(gè)攜帶線(xiàn)粒體tRNASer(UCN)G7444A突變耳聾家系中，母系人數(shù)共126人，其中26人發(fā)病，男16人，女10人。當(dāng)包括和不包括AmAn使用史時(shí)，耳聾的平均外顯率分別為20.6%和10.3%，明顯高于只攜帶線(xiàn)粒體tRNASer(UCN)G7444A突變家系耳聾外顯率，而這6個(gè)家系同時(shí)攜帶有其他突變位點(diǎn)（表3所示）。如NB133家系同時(shí)攜帶線(xiàn)粒體tRNASer(UCN)G7444A和線(xiàn)粒體12S rRNA C1494T突變，外顯率高達(dá)42.9%。SX003、YJ042和YJ049 3個(gè)家系同時(shí)攜帶線(xiàn)粒體tRNASer(UCN)G7444A和線(xiàn)粒體12S rRNA A1555G突變，平均發(fā)病率為29.4%。線(xiàn)粒體12S rRNA A1555G和C1494T突變是目前已知的與母系遺傳藥物性耳聾和非綜合征型耳聾發(fā)病密切相關(guān)的主要線(xiàn)粒體突變位點(diǎn)，世界各地已有多個(gè)相關(guān)報(bào)道[6，24-25]。不僅如此這幾個(gè)家系家系內(nèi)和家系間的母系成員在聽(tīng)力損失程度、發(fā)病年齡以及聽(tīng)力臨床表型上都存在很大差異[17-19，26-29]。因此，推測(cè)在這6個(gè)家系中，線(xiàn)粒體tRNASer(UCN)G7444A突變可能與線(xiàn)粒體12S rRNA A1555G和C1494T原發(fā)突變存在協(xié)同作用，共同影響非綜合征型耳聾的表型表達(dá)。除此之外，2001年，Abe等[30]報(bào)道了1個(gè)同時(shí)攜帶線(xiàn)粒體12S rRNA A1555G突變和GJB2基因突變的日本耳聾家系，并認(rèn)為GJB2基因突變加重了mtDNA突變導(dǎo)致的耳聾表型。Kokotas等[31]也報(bào)道了一個(gè)同時(shí)攜帶GJB 235delG雜合突變和線(xiàn)粒體tRNASer(UCN)G7444A同質(zhì)性突變的希臘耳聾家系。目前，僅在一些中國(guó)、日本、西班牙及希臘等耳聾家系中報(bào)道了GJB2基因突變和mtDNA突變協(xié)同致病現(xiàn)象[32]。本研究中發(fā)現(xiàn)的WLT024和WLT122家系同時(shí)攜帶線(xiàn)粒體tRNASer(UCN)G7444A和GJB2 235delC-/-突變，家系耳聾平均外顯率為19.0%。耳聾外顯率與只攜帶線(xiàn)粒體tRNASer(UCN)G7444A突變5個(gè)家系不考慮AmAn用藥史的情況下的平均外顯率差別不明顯，是否存在協(xié)同作用仍需要對(duì)家系進(jìn)行深入調(diào)查，并進(jìn)行進(jìn)一步的功能驗(yàn)證。

表3 11個(gè)攜帶線(xiàn)粒體tRNASer(UCN) G7444A突變耳聾家系臨床及分子遺傳學(xué)資料

3 討論

本研究探討了11個(gè)攜帶線(xiàn)粒體tRNASer(UCN)G7444A基因突變的中國(guó)漢族非綜合征型耳聾家系的臨床、家系、遺傳學(xué)特征及可能的分子致聾機(jī)制。這11個(gè)家系中，聽(tīng)力障礙作為唯一的臨床表型僅存在于母系成員中（除同時(shí)攜帶線(xiàn)粒體tRNASer(UCN)G7444A突變和GJB2 235delC的家系外），提示在這11個(gè)家系中耳聾的發(fā)病與線(xiàn)粒體DNA的突變密切相關(guān)。同時(shí)針對(duì)耳聾相關(guān)的熱點(diǎn)突變篩查發(fā)現(xiàn)，在2 650例中國(guó)漢族非綜合征型耳聾患者中，14例攜帶線(xiàn)粒體tRNASer(UCN)G7444A突變，突變率為0.53%，分屬于11個(gè)耳聾家系。在這11個(gè)攜帶線(xiàn)粒體tRNASer(UCN)G7444A突變的家系中，其中同時(shí)攜帶線(xiàn)粒體tRNASer(UCN)G7444A突變和線(xiàn)粒體12S rRNA A1555G、12S rRNA C1494T或GJB2 c.235delC的家系分別為3、1和2個(gè)。這6個(gè)家系中家系內(nèi)和家系間的母系成員在聽(tīng)力損失程度、發(fā)病年齡以及聽(tīng)力臨床表征上均存在很大差異。同時(shí)攜帶線(xiàn)粒體tRNASer(UCN)G7444A突變和線(xiàn)粒體12S rRNA A1555G、C1494T或GJB2 c.235delC突變的家系的耳聾平均外顯率分別為29.4%、42.9%和19.0%，而且同時(shí)攜帶線(xiàn)粒體tRNASer(UCN)G7444A突變和線(xiàn)粒體12S rRNA A1555G或C1494T突變家系耳聾的平均外顯率明顯高于只攜帶線(xiàn)粒體tRNASer(UCN)G7444A突變耳聾家系的平均外顯率14.0%。提示在這11個(gè)中國(guó)漢族非綜合征型耳聾家系中，攜帶線(xiàn)粒體tRNASer(UCN)G7444A突變和線(xiàn)粒體12S rRNA A1555G、C1494T或GJB2 c.235delC突變的6個(gè)家系線(xiàn)粒體tRNASer(UCN)G7444A突變可能與線(xiàn)粒體12S rRNA A1555G和C1494T原發(fā)突變存在協(xié)同作用，共同影響這些非中國(guó)漢族非綜合征型耳聾家系耳聾的表型。然而明確線(xiàn)粒體tRNASer(UCN)G7444A突變和線(xiàn)粒體12S rRNA A1555G或C1494T突變之間是否存在協(xié)同作用，進(jìn)一步揭示母系遺傳性耳聾的分子致病機(jī)制仍需要深入開(kāi)展功能驗(yàn)證相關(guān)研究。

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