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γ-氨基丁酸又名4-氨基丁酸 （4-aminobutyric acid）和γ-氨酪酸，簡稱 GABA，是一種天然活性成分，廣泛分布于動植物體內(nèi)。其分子式為C4H9NO2，相對分子量為103.2，結(jié)構(gòu)式如圖1。

圖1 GABA結(jié)構(gòu)式

GABA是一種抑制性神經(jīng)傳遞物質(zhì)，具有重要的生理活性，如：抗焦慮[1]，降血壓[2]，治療癲癇[3]，改善睡眠[4]，抗衰老[5]，調(diào)節(jié)激素分泌[6]及神經(jīng)營養(yǎng)[7]等。GABA已成為一種新型功能性因子，正廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和化工等領(lǐng)域。GABA可以用化學(xué)合成法生產(chǎn)，也可以以植物富集法、微生物發(fā)酵法生產(chǎn)。

從產(chǎn)品質(zhì)量檢測角度考慮，GABA測定方法的可靠性和準(zhǔn)確性至關(guān)重要。關(guān)于GABA的測定方法有很多種，如紙電泳法、紙層析法、比色法、高效液相色譜法和氨基酸分析儀測定法等，它們具有各自的優(yōu)缺點。本實驗以產(chǎn)GABA微生物發(fā)酵液為樣本對GABA的測定方法進(jìn)行了比較研究，確定了紙層析定性測定與高效液相色譜法定量測定GABA相結(jié)合的方法，優(yōu)化了HPLC的條件和參數(shù)。此法方便可行，準(zhǔn)確率較高。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

分析純試劑：無水乙酸鈉、正丁醇、冰醋酸、硼酸、三乙胺、OPA（鄰苯二甲醛）、β–巰基乙醇、茚三酮、谷氨酸鈉、磺基水楊酸。

γ–氨基丁酸（純度99%）購于杭州邁瑞化工儀器有限公司。

色譜純試劑：甲醇、乙腈。

1.2 主要溶液

1.2.1 紙層析用溶液

(1)不同展開劑

V(正丁醇):V(冰醋酸):V(水)=4:1:3；4:1:1；4:2:1；2:1:1；5:3:2；3:2:1

(2)茚三酮溶液

1.5 g茚三酮+100 mL正丁醇+3.0 mL醋酸

(3)γ–氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)溶液

準(zhǔn)確稱量100 mg標(biāo)準(zhǔn)γ–氨基丁酸，用超純水溶解后定容于100 mL容量瓶，得1 g/L的γ–氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)液，倒入試劑瓶，4℃冷藏備用。其它濃度的γ–氨基丁酸標(biāo)樣在使用時由該標(biāo)準(zhǔn)液稀釋而成。

1.2.2 高效液相色譜法用溶液

(1)衍生化試劑配制：將OPA 10 mg，β–巰基乙醇10 μL溶于2.5 mL乙腈。

(2)0.4 mol/L 硼酸緩沖液（pH=10.4）：取硼酸2.47 g，溶于100 mL超純水，調(diào)pH=10.4。

(3)0.02 mol/L 醋酸鈉緩沖液（pH=7.2）：取乙酸鈉1.64 g溶于1000 mL超純水，加入三乙胺180 μL，調(diào) pH=7.2。

1.3 實驗方法

1.3.1 發(fā)酵液γ-氨基丁酸的定性測定

發(fā)酵液離心除菌樣品經(jīng)紙層析分離、顯色后，不同氨基酸色斑的Rf值不同，因此可根據(jù)Rf值大小定性判斷。具體方法如下：

(1)點樣：將濾紙裁成適當(dāng)大小，寬度大約為15～20 cm，長度依據(jù)樣品的個數(shù)來決定，用鉛筆在距底邊2 cm的地方劃一道直線（稱為原線），線上每隔1 cm標(biāo)上一個點，寫上點樣標(biāo)記，然后用移液槍吸取2 μL發(fā)酵液的上清液，輕輕點在紙上標(biāo)記的位置；取1 g/L的γ–氨基丁酸標(biāo)樣和谷氨酸鈉標(biāo)樣點樣，作標(biāo)準(zhǔn)樣對照。點樣時應(yīng)保持濾紙潔凈。

(2)展開：在層析缸上端懸掛一條線，將展開劑倒入層析缸中，溶液高度約為1 cm，然后將濾紙點有樣品的一端緩緩放入缸內(nèi)的展開劑中并把濾紙懸掛于線上，濾紙應(yīng)避免接觸層析缸內(nèi)壁，紙的底部應(yīng)平行浸于展開劑中。

(3)顯色：展開3 h后，取出濾紙并用吹風(fēng)機將其吹干，再向濾紙上噴灑茚三酮溶液，吹干后，放于70℃電熱鼓風(fēng)箱中顯色5 min。

1.3.2 高效液相色譜法測定γ-氨基丁酸

(1)樣品預(yù)處理：用50 g/L的三氯乙酸稀釋發(fā)酵液上清液至適當(dāng)濃度，以0.45 μm的濾膜過濾待測。

(2)樣品衍生：吸取400 μL硼酸緩沖液，80 μL樣品溶液和OPA衍生試劑160 μL，混合后室溫反應(yīng)2 min。

(3)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：將1 g/L GABA標(biāo)樣依次稀釋至 0.8 g/L、0.6 g/L、0.4 g/L、0.2 g/L、0.1 g/L，衍生后分別吸取20 μL進(jìn)樣。HPLC條件為：流動相V(pH=7.5，0.02 mol/L 醋酸鈉緩沖液)：V（乙腈）=3:1， 色譜柱為 SunFireTMC18柱 （4.6mm×250mm,5 μm），檢測器為紫外檢測器，檢測波長為338 nm，流速為0.8 mL/min，洗脫時間10 min，進(jìn)樣量20 μL。以GABA的濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 氨基酸分析儀測定γ-氨基丁酸

(1)樣品處理：取發(fā)酵液1 mL于離心管中，加入9 mL 1%磺基水楊酸，混合后室溫靜置15 min，10000 rmp離心5 min；再取上清液用1%磺基水楊酸稀釋一定倍數(shù)，使樣品中氨基酸的濃度在100 nmol/mL范圍內(nèi)，取稀釋的樣品溶液過0.45 μm的濾膜后上機。

(2)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：用1%磺基水楊酸配制GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液20 mg/L，再將此濃度的標(biāo)樣用1%磺基水楊酸稀釋至 15 mg/L，10 mg/L，5 mg/L，1 mg/L，取標(biāo)樣溶液過0.45 μm的濾膜后上機。色譜條件為：色譜柱（PEEK 4.6 mm×150 mm），柱溫130℃，檢測波長 570 nm，進(jìn)樣量 50 μL，流速 0.7 mL/min，洗脫時間13 min。以GABA的濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 紙層析法

為達(dá)到更好的分離效果，比較了幾種不同配比的展開劑，其結(jié)果見表1。

表1 不同配比的展開劑對γ–氨基丁酸的層析效果

由表1可以看出，展開劑為V(正丁醇):V(冰醋酸):V(水)=4:1:3時，GABA和谷氨酸鈉的Rf值有明顯差異，且斑點清晰沒有脫尾，不易擴散，因此其對GABA和谷氨酸鈉的分離效果最好。其它展開劑均沒有此效果好，所以我們選用V(正丁醇):V(冰醋酸):V(水)=4:1:3作展開劑。其層析效果見圖2。

圖2 發(fā)酵液中GABA的紙層析結(jié)果

圖3 GABA標(biāo)樣的高效液相色譜圖

2.2 高效液相色譜法

2.2.1 GABA標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

在上述高效液相色譜條件下，GABA的保留時間為5.571 min，其色譜圖見圖3。以GABA濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖4。從圖4可以看出，在0～1 g/L范圍內(nèi)，峰面積和GABA的濃度之間的線性關(guān)系良好(R2=0.9994)，能用于GABA的定量分析。

圖4 GABA標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.2 發(fā)酵液的液相色譜圖

在上述色譜條件下，經(jīng)處理后的樣品液得到很好的洗脫和分離，在5.548 min時檢測到GABA，這和標(biāo)準(zhǔn)品出峰時間相同，其色譜圖見圖5。

2.2.3 精密度和回收率的測試

圖5 發(fā)酵液的高效液相色譜圖

為測定該方法的精密度，對0.5 g/L的GABA標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行5次平行測定，測定結(jié)果、標(biāo)準(zhǔn)偏差和RSD見表2。為確定該方法的準(zhǔn)確度，進(jìn)行了回收率試驗。將含有GABA的發(fā)酵液加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，再進(jìn)行衍生化處理進(jìn)樣測定，其回收率見表3。

表2 高效液相色譜法測定GABA精密度

表3 高效液相色譜法測定GABA的回收率

由表3可知，該方法的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.68%，精密度較高，重現(xiàn)性較好。從表3可得GABA平均回收率為97.4%，說明此測定方法的準(zhǔn)確度較好，可用于GABA定量測定。

2.3 氨基酸分析儀法

2.3.1 GABA標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

圖6 GABA標(biāo)品氨基酸色譜圖

圖7 GABA標(biāo)準(zhǔn)曲線

在上述氨基酸分析儀的操作條件下，檢測到GABA的出峰時間為10.89 min，其色譜圖見圖6。以GABA濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖7。從圖7得出，在1～20 mg/L范圍內(nèi)，峰面積和GABA的濃度之間的線性關(guān)系良好(R2=0.999)，適合GABA的定量分析。

2.3.2 發(fā)酵液的氨基酸色譜圖

處理后的發(fā)酵液送氨基酸分析儀檢測，得到很好的洗脫和分離，且峰形穩(wěn)定，發(fā)酵液中GABA出峰時間與標(biāo)準(zhǔn)品相同，其色譜圖見圖8。

3 結(jié)論

(1)紙層析法檢測GABA具有簡單、快速、有效等優(yōu)點，在展開劑 V(正丁醇)：V(冰醋酸)：V(水)=4:1:3條件下，得到的圖譜清晰、斑點明顯、無脫尾，可用于檢測發(fā)酵液中有GABA。另有文獻(xiàn)報道[8]，可將茚三酮直接加入展開劑中，展開后直接放于電烘箱中顯色，節(jié)省時間，此方法可做參考。

圖8 發(fā)酵液的氨基酸色譜圖

(2)高效液相色譜法和氨基酸分析儀法都能定量分析發(fā)酵液中GABA濃度。高效液相色譜法以鄰苯二甲醛作為衍生劑，用反相C18柱為分離柱，在338 nm下進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，此方法精密度較高，準(zhǔn)確度較好，但是操作過程較繁瑣。氨基酸分析儀法采用茚三酮柱后衍生，穩(wěn)定性好、靈敏度高、操作簡便，但要求樣品氨基酸濃度在100 nmol/mL范圍內(nèi)，使用費用高。出于經(jīng)濟(jì)和實驗條件考慮，選擇高效液相色譜法定量檢測GABA。

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