吉枝單，涂藝聲，丁明華，陳 雄，蔣秀芳

江西師范大學(xué) 功能有機小分子教育部重點實驗室，南昌 330022

蛇足石杉(Huperzia serrata (Thunb)Trev)又名千層塔、蛇足石松、蛇足草等，為石杉科石杉屬蕨類植物，全草具有解毒、止痛、散瘀消腫功效［1］。自1972 年中國科學(xué)院上海藥物研究所首次報道蛇足石杉植物中的生物堿石杉堿甲(Huperzine A，HupA)在動物實驗上有松弛橫紋肌的作用之后，已從中分得十幾個生物堿單體［2］，研究證明其中的HupA 是一種強效、可逆和高選擇性乙酰膽堿酯酶抑制劑。低劑量HupA 對乙酰膽堿酯酶(Ach E)有強大的抑制作用，并對阿爾茨海默癥(Alzheimer’s disease，AD)和重癥肌無力有良好的治療效果及有提高學(xué)習(xí)記憶力的功效［3］。隨著老齡化社會的到來，阿爾茨海默癥暨老年癡呆癥已成為人類的第四大病魔。據(jù)臨床試驗，石杉堿甲Hup-A)制劑是目前國內(nèi)外成功治療老年性癡呆癥的候選藥物。因化學(xué)合成的相應(yīng)成分取替天然石杉堿甲還有一定距離［4，5］，而野生蛇足石杉生長緩慢，8 年左右的成熟株高僅20～30 cm，人工大面積栽培尚難實現(xiàn)，加上因利益驅(qū)動所致的對野生資源的肆意采挖，致使蛇足石杉自然資源嚴重匱乏。利用現(xiàn)代生物工程生產(chǎn)天然石杉堿甲是解決該稀缺資源的新途徑［6，7］。國內(nèi)胡之璧先生實驗室報道，從蛇足石杉內(nèi)生真菌中篩選到2 株內(nèi)生真菌2F09P03B 和LQ2F01 具有能夠累積結(jié)構(gòu)不同而都具有抗乙酰膽堿酯酶活性的表現(xiàn)，取得了令人興奮的成果。目前，蛇足石杉莖段離體培養(yǎng)再生葉狀體產(chǎn)生石杉堿甲成分的研究報道鮮見，本研究為解決天然石杉堿甲資源匱乏找到了一條從葉狀體離體培養(yǎng)獲得之路，系植物器官工程生產(chǎn)植物源石杉堿甲的突破。

1 材料

1.1 植物材料

取自廬山多年生的野生蛇足石杉植株，由中國科學(xué)院廬山植物園詹遠懷研究員鑒定提供。

1.2 主要試劑和儀器

石杉堿甲(Huperzine A，HupA)標準品購自上海源葉生物科技有限公司(批號:20110111)，KQ3200DE 型數(shù)控超聲波清洗儀;TLC 板為青島海洋化工有限公司生產(chǎn)的硅膠G 板;Waters 2996 高效液相色譜儀。

2 方法

2.1 葉狀體的誘導(dǎo)

實驗采用上述蛇足石杉植株秋季的半木質(zhì)嫩莖。仔細將嫩莖清洗干凈、表面消毒，在無菌條件下，將葉片切割成5 mm×5 mm 或莖切割成5 mm 左右長，接種到準備好的的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中:①MS［8］;②MS+IAA0.5 mg/L;③1/2 MS+IAA0.5 mg/L;④1/4 MS+IAA0.5 mg/L;⑤6，7-V［9］+IAA0.5 mg/L。每瓶接種5 塊，每個處理重復(fù)4 次。

2.2 葉狀體的增殖培養(yǎng)

取誘導(dǎo)產(chǎn)生的葉狀體分割成小塊進行增殖培養(yǎng)條件優(yōu)化。增殖培養(yǎng)基以MS 或1/2MS 或6，7-V 為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度生長素IAA(0.1 mg/L～1.5 mg/L)、NAA、2，4-D 或IAA 與ZT 配合、不加任何激素的基本培養(yǎng)基(MS、1/2MS、B5、6，7-V)、蔗糖用量處理(g/L):10、15、20、25、30。每瓶接種約1 g，各種處理重復(fù)4 次，各培養(yǎng)基的pH 調(diào)至約5.8～6.2;培養(yǎng)在溫度(24 ±2)℃，每日光照14 h，光照強度1500 lx 左右。

2.3 培養(yǎng)物增殖量的測定計算

采取相對增長百分率進行對比，這樣可以消除因接種量的多少而產(chǎn)生的誤差。

相對增長百分率=(收獲量-接種量)/接種量×100%，每代生長期55 d。

2.4 培養(yǎng)物中生物堿的提取

參考王峻等［10］的方法作適當修改。葉狀體收獲后在60 ℃下烘干至恒重，用研缽研成粉末后，精確稱取粉末1.0 g 于試管中，加入10 mL 2%酒石酸溶液，密封，浸提10～15 h，然后在70 MHz 下55 ℃超聲1.5 h，濾出上清液;濾液加氨水調(diào)pH 至9～10，加入等體積氯仿，充分搖勻萃取，靜置30 min 待分層，重復(fù)3 次，合并氯仿層蒸發(fā)至干，加入適量甲醇溶解得生物堿提取液，用作TLC 點樣及高效液相檢測。

2.5 培養(yǎng)物中石杉堿甲定性檢測

薄層層析(TLC)檢測:參照周漢華等［11］方法有所改進，展開劑3 個:氯仿/丙酮/異丙醇(4∶4∶2，v/v/v)、氯仿/丙酮/異丙醇/氨水(4∶4∶2∶0.1，v/v/v/v)、氯仿-甲醇-氨水(6 ∶1 ∶0.1，v/v/v);顯色劑:0.2%高錳酸鉀溶液。將點樣的硅膠板置于預(yù)先飽和的展開劑中，待展開液離層析板另一端1 cm 處取出層析板，顯色后測其Rf 值。

2.6 培養(yǎng)物中石杉堿甲HPLC 檢測

參照王珊等［12］檢測方法。色譜柱:Waters C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);流動相:甲醇-醋酸銨(0.08 mol/L;pH=6)=3∶7;流速:0.8 mL/min;檢測波長:308 nm;柱溫:25 ℃;進樣量:15 μL。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同培養(yǎng)基組分對蛇足石杉外植體啟動葉狀體發(fā)生的差異

為了建立蛇足石杉組織培養(yǎng)繁殖系，筆者選擇了不同的基本培養(yǎng)基、不同的養(yǎng)分濃度及添加生長素誘導(dǎo)處理外植體。實驗結(jié)果表現(xiàn)，60 d 后有的培養(yǎng)基上分化出簇生葉狀體見圖1，70 d 統(tǒng)計結(jié)果見表1。外植體在較低養(yǎng)分濃度的培養(yǎng)基③、④、⑤上應(yīng)答啟動誘導(dǎo)率較高，蛇足石杉葉狀體誘導(dǎo)率在40%～50%，而培養(yǎng)基①、②誘導(dǎo)率低;對比培養(yǎng)基⑤與②、③、④，有明顯差異;說明蛇足石杉離體培養(yǎng)的啟動要求適宜的基質(zhì)配方，添加生長素能提高葉狀體的誘導(dǎo)率。

3.2 外源激素對葉狀體繼代增殖的影響

在已建立的無菌離體葉狀體基礎(chǔ)上，為了探索葉狀體繼代增殖培養(yǎng)基中激素的作用，設(shè)計了多因素隨機對比試驗，結(jié)果見表2。

表1 不同培養(yǎng)基配方誘導(dǎo)蛇足石杉試管葉狀體的啟動Table 1 Thallus induction of Huperzia serrata (Thunb.)Trev.in different culture medium

表2 激素對蛇足石杉試管葉狀體繼代增殖的效果Table 2 The effects of different media homen on growth of H.serrata thallus

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

由表3 不同激素不同濃度誘導(dǎo)葉狀體的增殖的方差分析中P ＜0.01，可以看出不同的培養(yǎng)基配方的作用極顯著。從表2 Duncan 各處理間平均數(shù)看出，不加任何激素的培養(yǎng)基A，平均相對增長率最高，增長率達到了10 倍左右。葉狀體在添加生長素2，4-D、NAA、IAA(0.1～1.0)mg/L 的不同濃度培養(yǎng)基上相對增長率均低于未添加激素的培養(yǎng)基A，說明外源激素對蛇足石杉離體葉狀體增殖具有明顯的抑制作用。

3.3 蔗糖用量對葉狀體繼代增殖的作用

在誘導(dǎo)外植體發(fā)生葉狀體階段，發(fā)現(xiàn)完全MS培養(yǎng)基的效果比1/2MS、1/4MS 以及6，7-V［10］誘導(dǎo)率低。但葉狀體的繼代增殖是脫離了外植體的組織器官增殖，為了探索其中主要碳源蔗糖的使用量，筆者設(shè)計了不同培養(yǎng)基質(zhì)及蔗糖用量的多因素隨機試驗，培養(yǎng)55d 統(tǒng)計各處理生物量鮮重，換算相對增殖率以消除接種差異。結(jié)果見表4，葉狀體在原始配方6，7-V、1/2MS、MS 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，最適的培養(yǎng)基是6，7-V。

表4 不同基質(zhì)與蔗糖用量對蛇足石杉試管葉狀體繼代增殖的差異Table 4 The effects of different media and used on growth of H.serrata thallus

表5 方差分析Table 5 Analysis of variance

由表5 葉狀體相對增殖率的方差分析中P ＜0.01，可以看出不同培養(yǎng)基種類的方差達到極顯著。由表4 Duncan 法分析各處理平均數(shù)可以看出，在MS 基本培養(yǎng)基里加入20 g/L 蔗糖時，葉狀體相對增殖率最高，平均為1362.6%。當培養(yǎng)基中蔗糖用量30 g/L 時，明顯不利于葉狀體的生長增殖。對比各處理，蔗糖用量以20 g/L 的MS 顯著優(yōu)于其他處理，表現(xiàn)更適宜葉狀體的生長增殖，同時也說明養(yǎng)分濃度與碳源的合適搭配能獲得更好的生物量。

3.4 葉狀體培養(yǎng)物中累積石杉堿甲的TLC

采取TLC 檢測不同培養(yǎng)基中培養(yǎng)的葉狀體抽提物，以石杉堿甲標準品和接種的母株干粉抽提物為對照TLC 檢測，試驗了不同的展開劑效果，篩選出氯仿/丙酮/異丙醇/氨水(4∶4∶2∶0.1，v/v/v/v)層析效果好，測得石杉堿甲標準品Rf=0.39，接種的母株和不同培養(yǎng)基中培養(yǎng)的葉狀體的抽提物中均出現(xiàn)與標準品相同的顯色斑點Rf=0.39，見圖2。證明培養(yǎng)物中能產(chǎn)生與接種母株含有的相同石杉堿甲成分，即存在與石杉堿甲標準品相同的成分。說明本研究獲得的葉狀體具有產(chǎn)生蛇足石杉有效成分石杉堿甲的能力。

圖1 蛇足石杉原植物及其離體培養(yǎng)誘導(dǎo)培養(yǎng)葉狀體過程Fig.1 H.serrata in wild and the progress of the thallus induction in vitro culture

圖2 蛇足石杉離體葉狀體提取物與石杉堿甲標準品、原植株提取物對照的TLCFig.2 The TLC test of extract of the wild H.serrata and thallus in vitro culture，Huperzine A standard

3.5 葉狀體培養(yǎng)物中累積石杉堿甲的HPLC

在色譜條件下檢測的圖3，其中D 石杉堿甲標準品的出峰時間為10 min 左右，最大吸收波長為308 nm。以1、2、3 μg/mL 標準品的濃度為橫坐標，面積為縱坐標，測得的線性關(guān)系為y=149987x-87338，r=0.9957;E 為培養(yǎng)物樣品HPLC 色譜圖，相同條件下10 min 左右有一個吸收峰，亦說明了石杉堿甲在培養(yǎng)物中累積，E 和D 說明樣品中異型結(jié)構(gòu)分子復(fù)雜多樣，可預(yù)知Huperzine A 的培養(yǎng)調(diào)控具較大的潛力。

圖3 蛇足石杉離體葉狀體培養(yǎng)物提取物及石杉堿甲標品的HPLCFig.3 The HPLC test of extract of thallus in vitro culture and Huperzine A standard

4 討論

國內(nèi)有多個實驗室開展了蛇足石杉的組織培養(yǎng)，但蛇足石杉組織培養(yǎng)再生葉狀體僅筆者實驗室成功。沈曉霞等人對千層塔莖尖組織培養(yǎng)滅菌方法的研究，經(jīng)過多種滅菌方法的摸索和比較，發(fā)現(xiàn)千層塔莖尖外植體的滅菌十分困難，并且外植體在光照培養(yǎng)4～5 d 后都發(fā)白死亡，無法繼續(xù)培養(yǎng)。只有在暗培養(yǎng)的條件下，莖外植體才保持嫩綠，在含有5 mg/L 2，4-D 和1 mg/L KT 的MS 基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)誘導(dǎo)，2 個月后長出褐色的愈傷組織，以后停止生長［13］。周穎等人報道蛇足石杉莖尖組織培養(yǎng)過程中，雖然已經(jīng)采取多種滅菌措施，仍然會被污染［14］。楊雪飛等采用表面滅菌和內(nèi)生菌殺滅相結(jié)合的方法使外植體的無菌率達到52%，但分化率較低［15］。孫玉強等離體培養(yǎng)千層塔外植體建立了愈傷組織，但生長速度慢［16］?？偨Y(jié)蛇足石杉莖外植體的組織培養(yǎng)的突出問題是:①外植體消毒困難;②再分化率低;③培養(yǎng)物生長慢，組織培養(yǎng)體系較難建立。

本研究解決了外植體的表面消毒問題，建立了再分化器官葉狀體的無性繁殖系。在植物次生代謝工程中，利用快速增殖的分化器官培養(yǎng)物生產(chǎn)天然有效成分，具有較穩(wěn)定的表達特征，例如以培養(yǎng)毛狀根生產(chǎn)中草藥有效成分的策略。因此本研究建立的葉狀體器官用于大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)石杉堿甲也可能表達較穩(wěn)定，尤其該葉狀體增殖率高，或可成為次生代謝工程最好的體系之一。本研究將進一步篩選高產(chǎn)石杉堿甲的葉狀體培養(yǎng)系，為大規(guī)模蛇足石杉次生代謝工程生產(chǎn)石杉堿甲邁上更高臺階，具有重要的科學(xué)意義和應(yīng)用價值。

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