龍 珍，龍騰云，黃仁彬，陳春霞，陳慶全，韋錦斌

廣西醫(yī)科大學藥理學教研室，南寧 530021

玉郎傘多糖(Yulangsan Polysaccharide，YLSPS)為豆科植物疏葉崖豆［Millettia Pulchra(Benth.)Kurz var.Laxior (Dunn)Z.Wei］的干燥根中提取的有效成分，由葡萄糖和阿拉伯糖組成，始見于《廣西中藥志》，為廣西壯、瑤醫(yī)常用藥材，具有補血、補氣、提高免疫力等功效［1］。YLSPS 多糖含量較多，并且作用廣泛，長期以來本課題組對其進行研究，發(fā)現(xiàn)YLSPS 具有抗自由基、抗氧化、抗衰老、抗高血壓和護肝等作用，并對抗癌和免疫增強有一定藥理作用。因此，為進一步研究YLSPS 的功效，本實驗通過建立環(huán)磷酰胺誘導的免疫抑制模型，擬研究YLSPS 對小鼠免疫器官指數(shù)、小鼠脾臟組織內乳酸脫氫酶和酸性磷酸酶活性及肝、脾巨噬細胞廓清指數(shù)和吞噬指數(shù)、二硝基氟苯誘導的遲發(fā)型超敏反應的影響，并對其抗應激能力進行檢測，進一步觀察YLSPS 對機體免疫功能的雙向調節(jié)作用，并初步探討其作用機制，為開發(fā)新一類免疫調節(jié)劑奠定基礎。

1 材料與儀器

1.1 動物

昆明種小鼠，雌雄各半，體質量20 ±2 g，由廣西醫(yī)科大學實驗動物中心提供，試驗動物質量合格證:SCXK 桂2009-0002。

1.2 藥物及試劑

玉郎傘多糖(本實驗室自行提取)，注射用環(huán)磷酰胺(通化茂祥有限公司，批號120802);鹽酸左旋咪唑片(廣西南國藥業(yè)有限公司，批號120103);乳酸脫氫酶測定試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號20120716);酸性磷酸酶測定試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號20120716);無水碳酸鈉分析純AR(衡陽市凱信化工試劑有限公司，批號20090411);印度墨水(solarbio，批號:18060)。

1.3 儀器

722S 型分光光度計(上海精密科學儀器有限公司);臺式高速冷凍離心機(德國SIGMA);FT-200高速分散勻質機;BD-326 型海爾臥式冷凍柜。

2 實驗方法

2.1 動物分組及給藥

SPF 級昆明種小鼠60 只，20 ±2 g，雌雄各半。實驗動物隨機分為6 組:空白對照組、環(huán)磷酰胺(CTX)模型組、陽性藥左旋咪唑組(LMS)和YLSPS低、中、高劑量組。除空白對照組外，其它各組小鼠于給藥的第1、3、5、7、9 d 皮下注射CTX(30 mg/kg)造模?？瞻讓φ战M用NS(0.1 mL/10 g)灌胃，LMS組用LMS［50 mg/(kg·d)］灌胃，YLSPS 低、中、高劑量組用YLSPS［150、300、600 mg/(kg·d)］灌胃。

2.2 胸腺、脾臟指數(shù)測定

末次給藥后小鼠禁食12 h，處死，分別取胸腺、脾臟稱濕重，計算胸腺、脾臟指數(shù)。胸腺(脾)指數(shù)=胸腺(脾)重量(mg)/［小鼠體重(g)×10］。

2.3 乳酸脫氫酶(LDH)及酸性磷酸酶(ACP)活性測定

按試劑說明進行乳酸脫氫酶(LDH)及酸性磷酸酶(ACP)活性測定。

2.4 對免疫抑制小鼠肝、脾巨噬細胞吞噬功能的影響

分組給藥、造模同2.1。末次給藥后0.5 h，于各鼠尾靜脈注射經4 倍稀釋的印度墨汁5 μL/g，于1 min(t1)和5 min(t5)后，分別從眼眶靜脈取血20 μL，加到1 g/L Na2CO3溶液2 mL 中搖勻，用分光光度計在680 nm 處測定t1和t5的吸光度值(A1，A5)，計算廓清指數(shù)K。之后，將小鼠處死，取肝臟及脾臟稱質量，計算吞噬指數(shù)α。廓清指數(shù)K=(logA1-logA5)/(t5-t1)=log(A1/A5)/4，吞噬指數(shù)α=體質量/(肝重+脾重)×K1/3。

2.5 對環(huán)磷酰胺免疫抑制小鼠遲發(fā)型過敏反應(DTH)的影響

分組給藥、造模同2.1。于第1 d 將每只小鼠腹部去毛3 ×3 cm2，將10 g/L 二硝基氟苯(DNFB)均勻涂抹于其上。末次灌胃后1 h，均在各組小鼠右耳均勻涂10 g/L 二硝基氟苯。攻擊24 h 后頸椎脫臼處死小鼠，剪下左右耳廓，用打孔器取下直徑8 mm的耳廓，稱質量，以左右耳廓重量之差作為腫脹度。

2.6 對小鼠負重游泳時間的影響

分組給藥、造模同2.1。末次給藥60 min 后，在小鼠尾根部束相當于其體重5%的重物，然后將其放入玻璃水缸(水深35 cm，水溫20 ±1 ℃)游泳，記錄各組小鼠的游泳時間，以小鼠沉入水中的時間為游泳時間。

2.7 對小鼠常壓耐缺氧的影響

分組給藥、造模同2.1。末次給藥60 min 后，將每只小鼠置于放有15 g 鈉石灰的250 mL 的廣口瓶中，并以凡士林密封瓶口，記錄和觀察其生存時間。

2.8 對小鼠耐低溫能力的影響

分組給藥、造模同2.1。末次給藥60 min 后，將小鼠置于-10 ±0.5 ℃的臥式冰柜的隔槽內，透過玻璃門蓋觀察并記錄小鼠在低溫條件下的呼吸停止時間。

2.9 對小鼠耐高溫能力的影響

分組給藥、造模同2.1。末次給藥60 min 后，將每只小鼠放入底部置有海綿墊的容積為1000 mL 的燒杯中，然后將燒杯放入恒溫水浴箱中(水溫為43±1 ℃)，觀察并記錄小鼠在高溫條件下的呼吸停止時間。

2.10 對亞硝酸鹽中毒性缺氧耐受性的影響

分組給藥、造模同2.1。末次給藥60 min 后，于各組小鼠腹腔注射5%亞硝酸鈉0.1 mL/10 g，觀察并記錄每只小鼠注射亞硝酸鈉后的呼吸停止時間。

2.11 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS13.0 軟件進行統(tǒng)計學處理，實驗數(shù)據(jù)的結果以均數(shù)±標準差()表示，各組均數(shù)之間比較采用One-way ANOVA 和組間多重比較，P ＜0.05 有統(tǒng)計學意義。

3 實驗結果

3.1 對免疫抑制小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的影響

從表1 可以看出與正常對照組比較，CTX 組胸腺指數(shù)，脾臟指數(shù)顯著降低(P ＜0.01)，給藥后，玉郎傘多糖中、高劑量組可顯著提高免疫抑制小鼠的胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)(P ＜0.01)(見表1)。

表1 玉郎傘多糖對免疫抑制小鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)的影響(n=10，)Table 1 Effects of YLSPS on thymus index and spleen index of immunosuppressive mice (n=10，)

表1 玉郎傘多糖對免疫抑制小鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)的影響(n=10，)Table 1 Effects of YLSPS on thymus index and spleen index of immunosuppressive mice (n=10，)

注:與空白對照組比較，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與環(huán)磷酰胺組比較，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。下表同。Note:compared with the control，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;compared with the CTX group，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01.Same as below.

3.2 對免疫抑制小鼠脾臟組織中LDH、ACP 活性的影響

與正常對照組比較，環(huán)磷酰胺組可明顯降低LDH、ACP 的活性(P ＜0.01);給藥后，玉郎傘多糖中、高劑量組可明顯提高免疫抑制小鼠的LDH 活性和ACP 活性(P ＜0.01)(見表2)。

表2 玉郎傘多糖對免疫抑制小鼠脾臟組織中LDH、ACP 活性的影響(n=10，)Table 2 Effects of YLSPS on LDH，ACP activities of spleen of immunosuppressive mice (n=10，)

表2 玉郎傘多糖對免疫抑制小鼠脾臟組織中LDH、ACP 活性的影響(n=10，)Table 2 Effects of YLSPS on LDH，ACP activities of spleen of immunosuppressive mice (n=10，)

3.3 對免疫抑制小鼠肝、脾巨噬細胞吞噬功能的影響

與正常對照組比較，環(huán)磷酰胺組肝、脾巨噬細胞廓清指數(shù)K、吞噬指數(shù)α 顯著低于正常對照組(P ＜0.01);給藥后，玉郎傘多糖中、高劑量組可明顯提高CTX 所致的免疫抑制小鼠的肝、脾巨噬細胞廓清指數(shù)K、吞噬指數(shù)α(P ＜0.01)。(見表3)

表3 玉郎傘多糖對免疫抑制小鼠肝、脾巨噬細胞吞噬功能的影響(n=10，)Table 3 Effects of YLSPS on the phagocytosis ability of macrophage of immunosuppressed mice (n=10，)

表3 玉郎傘多糖對免疫抑制小鼠肝、脾巨噬細胞吞噬功能的影響(n=10，)Table 3 Effects of YLSPS on the phagocytosis ability of macrophage of immunosuppressed mice (n=10，)

表4 玉郎傘多糖對免疫抑制小鼠遲發(fā)型超敏反應的影響(n=10，)Table 4 Effects of YLSPS on ear swellings of immunosuppressive mice (n=10，)

表4 玉郎傘多糖對免疫抑制小鼠遲發(fā)型超敏反應的影響(n=10，)Table 4 Effects of YLSPS on ear swellings of immunosuppressive mice (n=10，)

3.4 對環(huán)磷酰胺免疫抑制小鼠遲發(fā)型過敏反應(DTH)的影響

與正常對照組比較，環(huán)磷酰胺組耳腫脹度顯著低于正常對照組(P ＜0.01);給藥后，玉郎傘多糖中、高劑量組可明顯提高CTX 所致免疫抑制小鼠的耳腫脹度(P ＜0.01)(見表4)。

3.5 對環(huán)磷酰胺免疫抑制小鼠抗應激能力的影響

從表5 實驗結果可以看出，與環(huán)磷酰胺組相比較，玉郎傘多糖低、中、高劑量組均可以延長小鼠負重游泳時間和耐低溫存活時間(P ＜0.05)，尤其以高劑量組更為明顯(P ＜0.01)。同時，玉郎傘多糖中、高劑量組也提高小鼠耐高溫存活時間(P ＜0.05)。

表5 玉郎傘多糖對小鼠負重游泳時間、耐低溫存活時間、耐高溫存活時間的影響(n=10，)Table 5 Effects of YLSPS on loaded swimming time，low temperature survival time and high temperature survival time of immunosuppressive mice(n=10，)

表5 玉郎傘多糖對小鼠負重游泳時間、耐低溫存活時間、耐高溫存活時間的影響(n=10，)Table 5 Effects of YLSPS on loaded swimming time，low temperature survival time and high temperature survival time of immunosuppressive mice(n=10，)

從表6 實驗結果可以看出，與環(huán)磷酰胺組相比較，玉郎傘多糖低、中、高劑量組均可提高小鼠在常壓耐缺氧情況下的存活時間(P ＜0.05)，以高劑量組明顯(P ＜0.01)。而玉郎傘多糖的中、高劑量組可以提高小鼠的中毒性耐缺氧存活時間(P ＜0.05)。

表6 玉郎傘多糖對小鼠常壓耐缺氧和中毒性耐缺氧存活時間的影響(n=10，)Table 6 Effects of YLSPS on survival times of immunosuppressive mice under normal pressure anoxia environment and nitrite poisoning anoxia environment(n=10，)

表6 玉郎傘多糖對小鼠常壓耐缺氧和中毒性耐缺氧存活時間的影響(n=10，)Table 6 Effects of YLSPS on survival times of immunosuppressive mice under normal pressure anoxia environment and nitrite poisoning anoxia environment(n=10，)

4 討論

目前研究表明，多糖具有免疫活性，且具有毒副作用小、多效性、雙向調節(jié)性等特點［2］。玉郎傘多糖具有較強的抗氧自由基作用［3］和抗腫瘤及免疫調節(jié)活性［4］。機體的免疫功能通常由細胞免疫、體液免疫以及非特異性免疫反應組成［5］。脾臟和胸腺都是重要的免疫器官，濕重指數(shù)可反映它們的功能狀況。巨噬細胞為機體免疫系統(tǒng)中重要的免疫細胞，具有吞噬細胞、誘發(fā)特異性免疫應答、參與免疫調節(jié)等多種作用，其吞噬指數(shù)是反映機體非特異性免疫功能的指標［6］。而LDH 廣泛存在于機體的組織器官中和巨噬細胞的胞液內，其與巨噬細胞激活的程度相關，是巨噬細胞激活的標志之一［7］。ACP是高等動物體內巨噬細胞溶酶體酶的標志，它的高低也反映了巨噬細胞被激活的程度［8］。遲發(fā)型變態(tài)反應是由T 細胞介導的細胞免疫應答的一種類型，也是常見的一種免疫反應［9］。此外，長期應激導致多種疾病，如高血壓、冠心病、甲亢、消化性潰瘍等，慢性應激造成脂質和過氧化物長期積蓄可損害生物膜，導致細胞發(fā)生退行性變化，加速機體器官的老化。小鼠負重游泳時間、常壓缺氧、低溫和高溫環(huán)境下的存活時間以及對亞硝酸鹽中毒性缺氧耐受性是衡量藥物抗應激的常用指標。本實驗選擇左旋咪唑作為陽性對照藥，進一步研究玉郎傘多糖的免疫調節(jié)功能。

本實驗結果顯示，玉郎傘多糖能使小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)顯著增加(P ＜0.05)，這表明不同劑量組的玉郎傘多糖均可促進胸腺、脾臟組織細胞生長代謝，改善機體免疫功能。同時，玉郎傘多糖中、高劑量組可使機體LDH、ACP 活性上調(P ＜0.05)，這表明玉郎傘多糖能夠激活巨噬細胞。在本實驗中，我們還發(fā)現(xiàn)玉郎傘多糖對環(huán)磷酰胺所致的免疫抑制小鼠肝、脾巨噬細胞吞噬能力有促進作用，可以增強小鼠非特異性免疫功能。同時，玉郎傘多糖中、高劑量能顯著增強免疫低下小鼠的遲發(fā)型超敏反應，提示玉郎傘多糖能提高免疫低下小鼠的細胞免疫功能。另外玉郎傘多糖能延長小鼠負重游泳時間、常壓缺氧存活時間、耐低溫存活時間、耐高溫存活時間，能增強小鼠的抗應激能力，使機體適應外界環(huán)境突發(fā)的變化。

綜上所述，玉郎傘多糖可作用于免疫系統(tǒng)的多個環(huán)節(jié)，對免疫低下小鼠的非特異性免疫、特異性免疫均有一定增強作用，拮抗因CTX 而造成的免疫低下狀態(tài)。

1 Dai XD(戴向東)，Qiu CE(丘翠嫦)，Dai B(戴斌)，et al.玉郎傘的化學成分分析.Chin J Ethnomed Ethnopharm (中國民族民間醫(yī)藥雜志)，2009，18(20):9.

2 He QT(賀青提)，Zhang S(張松).Advances in the studies on the mechanism of immuno-potentiation effect of polysaccharides from edible-medicinal fungi.Acta Edulis Fungi(食用菌學報)，2004，11(2):52-58.

3 Chen J(陳健)，Huang YH(黃媛恒)，Wang NP(王乃平)，et al.玉郎傘多糖和皂苷對氧自由基清除作用研究.Pharmacol Clinics Chin Mater Med(中藥藥理與臨床)，2007，23:100-102.

4 Cai WE(蔡文娥)，Zhang XD(張緒東)，Huang RB(黃仁彬)，et al.Study on immunological effect of Yulangsan polysaccharides.Lishizhen Med MaterMed Res(時珍國醫(yī)國藥)，2011，22:1681-1683.

5 Yang Y(楊穎)，Cai W(蔡玟)，Huang JM(黃俊明).The effect of two forms of extracts of Radix Panacis Quinquefolii on immunomodulatory of mice.South China J Prevent Med(華南預防醫(yī)學)，2003，1:15-17.

6 Wang YF(王玉鳳)，F(xiàn)eng LY(鳳良元)，Yan SQ(鄢順琴)，et al.Effect of Fructus Broussonetiae on immunological function in immunosuppressive mice induced by cyclophosphamide.Chin Arch Tradit Chin Med(中華中醫(yī)藥學刊)，2008，26:1023-1025.

7 Koike M，Sekigawa I，OkadaM，et al.Relationship betweenCD4(+)/CD8(+)T cell ratio and T cell activation in multiple myeloma:reference to IL-16.Leuk Res，2002，26:705-711.

8 Al-Sakkaf L，Pozzilli P，Tarn AC，et al.Persistent reduction of CD4/CD8 lymphocyte ratio and cell activation before the onset of type 1 (insulin-dependent)diabetes.Diabetologia，1989，32:322-325.

9 Li R(李榮)，Li J(李俊)，Hu CM(胡成穆)，et al.Immunomodulative effect of hesperidin on immunodepressed mice.Chin Pharm Bull(中國藥理學通報)，2007，23:169-172.