文全泰 ，潘廷啟，黃禮德，李蕓達(dá)，趙善民，何顯教，黃彥峰，晉 玲

1右江民族醫(yī)學(xué)院臨床學(xué)院;2 百色市人民醫(yī)院;3 右江民族醫(yī)學(xué)院 生理學(xué)教研室，百色 533000

土人參［Talinum paniculatum (Jacq.)Gaertn.］為馬齒莧科土人參類(lèi)植物，別名為櫨蘭、假人參等。有補(bǔ)中益氣，養(yǎng)陰潤(rùn)肺，消腫止痛，主治脾虛、食少乏力、泄瀉、脫肛、肺癆咳血、潮熱、盜汗，產(chǎn)后乳汁不足等癥［1］，研究表明土人參含有的成分為齊墩果酸、蔗糖等［2］，而其中多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、降糖、保肝、抗感染、抗消化道潰瘍、抗衰老、降血脂、抗凝血等作用［3］。也有研究表明土人參含環(huán)烯醚萜，有類(lèi)似地黃養(yǎng)陰、生津、益精填髓的作用，同時(shí)含三萜皂苷，亦有類(lèi)似人參大補(bǔ)元?dú)?，補(bǔ)脾益氣、生津、安神、增強(qiáng)免疫機(jī)能之功效。此外尚含香豆素類(lèi)、揮發(fā)油等［4］。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于土人參抗氧化的研究?jī)H有張健，劉關(guān)艷通過(guò)測(cè)定土人參葉和根中的抗氧化物質(zhì)的含量和抗氧化酶的活性，得出土人參中SOD活性較高，總抗氧化能力較強(qiáng)［5］，但其未對(duì)動(dòng)物進(jìn)行任何實(shí)驗(yàn)研究，因此在動(dòng)物方面的研究尚存欠缺，為此本次實(shí)驗(yàn)以不同濃度的土人參提取液對(duì)D-半乳糖所致衰老小鼠心、肝組織中SOD 和MDA 含量以及血清中GSH-PX 活性的影響來(lái)研究其抗氧化能力，這樣即進(jìn)一步探討土人參的抗氧化作用，也為土人參的臨床藥物應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

昆明種3 月齡清潔級(jí)小白鼠50 只，雌雄各半，體重35～45 g，由廣西右江民族醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供(許可證號(hào):SYXK 桂2011-0010)。土人參采摘于廣西天等縣高州山，由右江民族醫(yī)學(xué)院民族醫(yī)學(xué)教研室覃道光副教授鑒定為馬齒莧科土人參類(lèi)植物;D-半乳糖(批號(hào)20120718)，購(gòu)自美國(guó)Amresco公司，用生理鹽水配成1.25%的濃度。超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(批號(hào)20121120)、丙二醛(MDA)試劑盒(批號(hào)20121118)、考馬斯亮蘭試劑盒(批號(hào)20121120)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSHPX)試劑盒(批號(hào)20121122)均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

電熱恒溫水浴鍋(江蘇金壇宏凱儀器廠);TDZ4A-WS 低速臺(tái)式離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司);FSH-2A 可調(diào)高速電動(dòng)勻漿機(jī)(金壇市金南儀器廠);電熱煮沸消毒器(100 度恒溫水浴鍋)(上海市化工進(jìn)出口有限公司);722 型分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司);SW-80A 型旋渦混合器(上海醫(yī)大儀器廠);ARll40/C 電子天平［奧豪斯(上海)公司生產(chǎn)］。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 土人參提取液制備

稱取500 g 土人參干品，先用適量蒸餾水浸泡1 h，再加入部分蒸餾水，兩次共為干品10 倍，煮沸30 min，自然冷卻至室溫后過(guò)濾，保存為濾液1;同法再加入8 倍的蒸餾水，煮沸30 min 后過(guò)濾，保存為濾液2。將1、2 液混合，減壓濃縮至100%(1 mL 含生藥1 g)，作為原藥液，置于5 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫R用前按比例配制成高劑量為15 g/kg，中劑量10 g/kg，低劑量為5 g/kg。

1.2.2 動(dòng)物的分組及造模

取體重35～45 g 的昆明種小白鼠50 只，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d 后，將小鼠隨機(jī)分為5 組，每組10 只，即為正常對(duì)照組、衰老模型組、土人參提取液高、中、低劑量組。D-半乳糖衰老小鼠模型的建立及給藥方法參照文獻(xiàn)［6］方法制備亞急性衰老小鼠模型。即土人參提取液低、中、高劑量組及衰老模型組每日定時(shí)頸背部皮下注射(125 mg/kg［7］體重)的D-半乳糖滅菌生理鹽水溶液(新鮮配制，其濃度為1.25%)，正常對(duì)照組頸背部皮下注射等量的生理鹽水，連續(xù)42 d。同時(shí)，將土人參提取液分別配成劑量為15、10、5 g/kg 依次給高劑量組、中劑量組、低劑量組灌胃，正常對(duì)照組和衰老模型組給予等量的生理鹽水灌胃，每天灌胃1 次，連續(xù)給藥42 d，并于每周稱量體重后，根據(jù)體重準(zhǔn)確調(diào)整給藥量及D-半乳糖注射量，并保持給藥的連續(xù)性和準(zhǔn)確性。

1.2.3 血清及組織勻漿液的制備

于42 d 后對(duì)各小組小鼠采用摘除眼球法，取血0.5～1.0 mL 放入容積為1 mL 的三角試管中，以3500 rpm，離心10 min，取上清液備用。隨即采用頸椎脫臼法處死小鼠，迅速取出其心、肝組織，用冰凍生理鹽水洗凈，濾紙吸干稱重，用勻漿機(jī)勻漿(15000 rpm，連續(xù)3～5 次)制備成10%的組織勻漿液，備用。并根據(jù)試驗(yàn)要求取部分10%的組織勻漿液用生理鹽水按1∶9 稀釋成1%的組織勻漿液，加藥并離心(3000 rpm，10 min)，制備成1%的組織勻漿液，備用。

1.2.4 生化指標(biāo)檢測(cè)

小鼠血清中的GSH-PX 和心、肝組織中的蛋白量、SOD、MDA 含量的測(cè)定均按南京建成生物工程研究所提供的試劑盒說(shuō)明書(shū)方法進(jìn)行操作。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行處理，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x ±S)表示，資料進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn);多組計(jì)量資料采用one-way ANOVA，方差齊時(shí)采用LSD，方差不齊時(shí)采用Dunnett's C 法。P ＜0.05 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 土人參提取液對(duì)D-半乳糖所致衰老小鼠血清GSH-PX 和心、肝組織SOD 含量的影響

與正常對(duì)照組相比，衰老模型組小鼠血清中GSH-PX 和心、肝組織中的SOD 含量明顯降低，具有顯著差異(P ＜0.01);與衰老模型組相比，土人參提取液低、中、高劑量組小鼠血清中的GSH-PX 和心臟、肝臟中的SOD 含量均明顯升高，具有顯著差異(P ＜0.01)，結(jié)果見(jiàn)表1、2。

表1 土人參提取液對(duì)D-半乳糖所致衰老小鼠心、肝組織SOD 含量的影響(x ±S，n=10)Table 1 Effects of T.crassifolium extract on SOD in heart and liver tissue of aged mice induced by D-galactose (x ±S，n=10)

表2 土人參提取液對(duì)D-半乳糖所致衰老小鼠血清中GSHPX 含量的影響(x ±S，n=10)Table 2 Effects of T.crassifolium extract on GSH-PX in serum of aged mice induced by D-galactose (x ±S，n=10)

注:與正常對(duì)照組比較，1)P ＜0.05，2)P ＜0.01;與模型組比較，3)P＜0.05，4)P ＜0.01。Note:Compared with normal control group，1)P ＜0.05，2)P ＜0.01;Compared with model group，3)P ＜0.05，4)P ＜0.01.

2.2 土人參提取液對(duì)D-半乳糖所致衰老小鼠心、肝組織MDA 含量的影響

與正常對(duì)照組相比，衰老模型組小鼠心臟、肝臟的MDA 含量明顯升高，具有顯著差異(P ＜0.01);與衰老模型組相比，土人參提取液中、高劑量組小鼠心臟、肝臟中的MDA 含量明顯降低，具有顯著差異(P ＜0.01)，但是土人參提取液的低劑量組中的心臟的MDA 降低不明顯(P ＞0.05)，而土人參提取液低劑量組小鼠肝臟MDA 含量明顯降低，具有顯著差異(P ＜0.01)，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 土人參提取液對(duì)D-半乳糖所致衰老小鼠心、肝組織MDA 含量的影響(x ±S，n=10)Table 3 Effects of T.crassifolium extract on MDA in heart and liver tissues of aged mice induced by D-galactose (x±S，n=10)

3 討論

自上世紀(jì)二十年代自由基學(xué)說(shuō)創(chuàng)立以來(lái)，對(duì)于自由基損傷的研究就不斷深入。許多研究證實(shí)，體內(nèi)自由基含量是隨著年齡增長(zhǎng)而積累的，但體內(nèi)產(chǎn)生抗氧化劑和氧化酶能力卻隨年齡增加而逐漸下降。自由基的氧化可出現(xiàn)肌膚衰老，色斑，松弛，免疫系統(tǒng)衰退及全身性老化等一系列現(xiàn)象，因此，減少自由基的產(chǎn)生及尋找有效的抗氧化性藥物，對(duì)人類(lèi)的生命與健康有著重要意義。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)與D-半乳糖所致衰老模型相對(duì)比，來(lái)研究土人參提取液的抗氧化作用。

研究表明大劑量D-半乳糖可引起多組織基因表達(dá)與調(diào)控異常、細(xì)胞增殖分化能力下降及細(xì)胞退行性改變等表現(xiàn)，其機(jī)制可能是D-半乳糖誘導(dǎo)活性氧增多，脂質(zhì)過(guò)氧化亢進(jìn)，產(chǎn)生超氧陰離子自由基［8］。同時(shí)脂質(zhì)過(guò)氧化分解產(chǎn)物MDA 能使DNA、蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)，影響細(xì)胞的分裂，破壞蛋白和酶的結(jié)構(gòu)和功能［9］，因此，測(cè)試MDA 的量?？煞从硻C(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化的程度，同時(shí)也可間接地反映出細(xì)胞損傷程度。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，與正常對(duì)照組小鼠相比，衰老模型組小鼠中的心、肝臟組織中MDA 的含量明顯的升高，說(shuō)明由D-半乳糖所致衰老模型組小鼠已經(jīng)出現(xiàn)細(xì)胞損傷，并達(dá)到一定程度，同時(shí)也表明衰老模型是制備成功的。而土人參提取液中、高劑量組小鼠心臟、肝臟中的MDA 含量與衰老模型組相比也明顯降低，土人參提取液低劑量組小鼠肝臟MDA 含量同樣明顯降低。說(shuō)明土人參提取液具有抑制MDA 生成，減少細(xì)胞損傷的作用。

谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-PX)是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種重要的催化過(guò)氧化氫分解的酶。它特異的催化還原型谷胱甘肽對(duì)過(guò)氧化氫的還原反應(yīng)，可以起到保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整的作用。超氧化物歧化酶(SOD)對(duì)機(jī)體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用，此酶能清除超氧陰離子自由基保護(hù)細(xì)胞免受損傷。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知:土人參提取液三個(gè)劑量組小鼠血清中的GSH-PX 和心臟、肝臟中的SOD 活性與衰老模型組相比均有明顯升高，說(shuō)明土人參提取液可以通過(guò)提高SOD 和GSH-PX 的活性，從而達(dá)到抗自由基氧化及保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的作用。土人參對(duì)抗衰老與提高免疫力、抗疲勞有緊密聯(lián)系，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，控制內(nèi)分泌，延緩細(xì)胞衰老進(jìn)程，全面提高人體免疫等起明顯的作用，是一種難得的滋補(bǔ)強(qiáng)壯劑，有促進(jìn)人的食欲、睡眠、疲乏等癥狀的改善，這種功效可能是土人參中的環(huán)烯醚萜、三萜皂苷及糖類(lèi)等成分起作用。因此綜合以上分析證明土人參提取液具有抗氧化，延緩衰老的作用。

研究表明土人參是比較安全且無(wú)毒性的植物［10］，同時(shí)在價(jià)格上相對(duì)便宜，并且野外生長(zhǎng)資源豐富，因此可以根據(jù)土人參的抗氧作用，將其由原來(lái)的野生植物變成預(yù)防衰老的保健產(chǎn)品，這樣不僅可以充分發(fā)揮土人參的藥用功效，而且也為人類(lèi)的健康做出貢獻(xiàn)，同時(shí)也展示出我國(guó)中草藥的獨(dú)特魅力。

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