席守民，安君嶺，趙煥東，溫新麗，高永忠

1河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)與醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，洛陽 471003;2 永城市中心醫(yī)院，永城 476600

氧自由基對腦神經(jīng)細(xì)胞的氧化修飾作用是導(dǎo)致神經(jīng)元損傷的主要途徑之一，在帕金森病和阿爾茨海默病的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要的地位［1］。H2O2是一種比較常用的細(xì)胞氧化誘導(dǎo)劑，廣泛用于誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激模型。有研究認(rèn)為阿爾茨海默病與神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)，而細(xì)胞凋亡與氧自由基密切相關(guān)［2］。增殖細(xì)胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen，PCNA)在細(xì)胞增殖過程中起重要作用，是評價(jià)細(xì)胞增殖狀態(tài)的重要指標(biāo)［3］。蝸牛提取物中的某些成分具有增強(qiáng)細(xì)胞活力、促進(jìn)組織細(xì)胞修復(fù)和再生的作用［4］。為了探討蝸牛多肽混合物(snail polypeptide mixture，SPM)對神經(jīng)元細(xì)胞的保護(hù)作用，本文用H2O2造成人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株(SHSY5Y)細(xì)胞氧化損傷模型，觀察SPM 對SH-SY5Y細(xì)胞的抗凋亡效果，為SPM 神經(jīng)保護(hù)作用的深入研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株(SH-SY5Y)購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所;白玉蝸牛，洛陽綠爾農(nóng)業(yè)科技有限公司惠贈;小牛血清、DMEM 購自美國Gibco BRL 公司;Hoechst 染色試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;兔抗人單抗PCNA:武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn);SP 免疫組化試劑盒購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司;DAB 顯色試劑盒購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司。

1.2 蝸牛多肽混合物的制備

參照文獻(xiàn)［5］中的方法，取新鮮白玉蝸牛200 g，剁成小塊;將蝸牛組織加到500 mL 預(yù)冷的pH 3.5的冰醋酸溶液，膠體磨反復(fù)勻漿;勻漿液4 ℃，5500 rpm 離心10 min，取上清;55 ℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至體積為100 mL;濃縮液凍干，交聯(lián)葡聚糖凝膠G-25分離層析，得到4個(gè)峰，分別收集，MTT 法體外活性實(shí)驗(yàn)檢測第2 峰值活性最強(qiáng)。收集第2 峰樣品，濃縮凍干，BCA 法測定樣品中蛋白質(zhì)含量為84.81%，氧化酶法測定樣品中葡萄糖含量僅為0.24%，即為蝸牛多肽混合物，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理

SH-SY5Y 用含2 mmol/L 谷氨酰胺和10%小牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，在37 ℃5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隔天傳代細(xì)胞，當(dāng)傳代細(xì)胞在倒置顯微鏡下觀察均勻貼壁生長時(shí)，可用于實(shí)驗(yàn)研究。

1.4 MTT 法檢測H2O2對SH-SY5Y 細(xì)胞的損傷作用

將生長狀態(tài)良好的SH-SY5Y 細(xì)胞以1 ×104細(xì)胞/孔接種于96 孔板，待細(xì)胞貼壁。細(xì)胞貼壁后棄去培養(yǎng)液，每孔加含不同濃度(0.25～6.0)mmol/L H2O2的培養(yǎng)液200 μL，陰性對照組加不含H2O2的培養(yǎng)液200 μL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后每孔加入5 g/L MTT 溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后棄去培養(yǎng)液，每孔加入200 μL 二甲基亞砜(DMSO)，震蕩5 min 后酶標(biāo)儀490 nm 處檢測每孔的吸光度(A)值。細(xì)胞存活率=給藥組A 值/陰性對照組A 值×100%。Orgin 軟件計(jì)算半數(shù)抑制濃度IC50。

1.5 MTT 法測定SPM 對H2O2誘導(dǎo)SH-SY5Y 細(xì)胞損傷的抑制作用

取對數(shù)生長期的SH-SY5Y 細(xì)胞，以1 ×104細(xì)胞/孔接種于96 孔板，待細(xì)胞貼壁。細(xì)胞貼壁后模型組以1.54 mmol/L H2O2作用于SH-SY5Y 細(xì)胞。治療組分別以不同濃度(39～1250)mg/L SPM 和1.54 mmol/L H2O2作用于SH-SY5Y 細(xì)胞。對照組只加SH-SY5Y 細(xì)胞，不加藥物。細(xì)胞給藥24 h 后每孔加20 μL 濃度為5 g/L 的MTT 溶液。繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后棄去培養(yǎng)液，每孔加入200 μL DMSO，震蕩5 min 后酶標(biāo)儀490 nm 處檢測A 值。

1.6 Hoechst 染色檢測細(xì)胞凋亡

Hoechst 33342 可與凋亡細(xì)胞凝集的染色質(zhì)結(jié)合，使其發(fā)出強(qiáng)藍(lán)色熒光，從而與正常細(xì)胞加以區(qū)別［6］。將SH-SY5Y 細(xì)胞接種于24 孔板，培養(yǎng)24 h后，分4 組，H2O2組:加1.54 mmol/L H2O2;對照組:正常細(xì)胞培養(yǎng)，不加藥物;SPM-L 組:加蝸牛多肽混合物39 mg/L 和1.54 mmol/L H2O2;SPM-H 組:加蝸牛多肽混合物156 mg/L 和1.54 mmol/L H2O2。再培養(yǎng)24 h 后，用PBS 洗3 次，加入新鮮配制的4%多聚甲醛固定細(xì)胞10 min，PBS 洗后用濃度為10 mg/L 的Hoechst 33342 染液作用于細(xì)胞，避光孵育15 min，PBS 小心沖洗后熒光顯微鏡下觀察攝片。每孔隨機(jī)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，計(jì)算凋亡細(xì)胞百分比。

1.7 細(xì)胞免疫化學(xué)技術(shù)檢測細(xì)胞PCNA 的表達(dá)

取對數(shù)生長期SH-SY5Y 細(xì)胞消化制備細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為l×104個(gè)/mL，接種于內(nèi)置無菌玻片的6 孔板內(nèi)。培養(yǎng)24 h 后，分4 組(同1.6 分組)，以上各組平行3 孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后，爬片用PBS 漂洗2 遍，經(jīng)4%多聚甲醛固定30 min，PBS 洗滌后自然風(fēng)干。檢測方法按免疫組化試劑盒說明書進(jìn)行。

1.8 Western blot 檢測細(xì)胞PCNA 的表達(dá)

取對數(shù)生長期SH-SY5Y 細(xì)胞，接種于內(nèi)置無菌玻片的6 孔板內(nèi)。培養(yǎng)24 h 后，分4 組，加入不同藥物處理(同1.6 分組)。以上各組平行3 孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后，每孔分別加入120 μL 蛋白裂解液裂解后，在冰浴下靜置裂解30 min，95 ℃加熱5 min后，取25 μL 品進(jìn)行10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結(jié)束后取出凝膠，于4 ℃下60 mA 電流轉(zhuǎn)印過夜至硝酸纖維素膜，脫脂奶粉封閉1 h 后，分別加入1∶1000 稀釋的PCNA 單抗4 ℃過夜，洗膜后用1∶2000 稀釋的二抗-辣根過氧化酶(HRP)交聯(lián)物孵育2 h，按照Super Signal west pico chemiluminescent substrate 試劑盒(PIERCE 公司，美國)說明，加入顯色劑后，X 光片于室溫下自顯影20 s，使用凝膠分析系統(tǒng)攝像并分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 實(shí)驗(yàn)

2.1 H2O2對SH-SY5Y 細(xì)胞存活率的影響

MTT 法檢測分析顯示，(0.25～6.0)mmol/L 不同濃度的H2O2處理SH-SY5Y 細(xì)胞24 h 后，該細(xì)胞的存活率呈濃度依賴性降低。通過Orgin 軟件計(jì)算可知，H2O2對SH-SY5Y 細(xì)胞IC50為1.54 mmol/L，見圖1。

圖1 MTT 法檢測不同濃度的H2O2處理后的SH-SY5Y細(xì)胞存活率Fig.1 Viability of SH-SY5Y cells in different concentrations of H2O2

2.2 MTT 法測定SPM 抗H2O2誘導(dǎo)SH-SY5Y 細(xì)胞毒性

圖2 顯示采用MTT 法檢測H2O2及SPM 處理后的SH-SY5Y 細(xì)胞存活率結(jié)果。A 組(H2O2組)顯示，加入1.54 mmol/L H2O2作用24 h 后，SH-SY5Y細(xì)胞存活率僅為(47.65 ±3.52)%，而同時(shí)加入不同濃度的蝸牛多肽的治療組的細(xì)胞生長力明顯較A組好。B 和C 組與A 組比較差異有顯著性意義(tB=-7.41，PB=0.018，tC=-7.85，PC=0.016)，D～G組分別與A 組比較差異有顯著性意義(tD=-21.30，PD=0.002，tE=-186.20，PE=0.000，tF=-54.54，PF=0.000，tG=-42.65，PG=0.001)，但B 組與C組比較以及D～G 組之間比較均無明顯差異性。提示低劑量39 mg/L(SPM-L)和高劑量156 mg/L(SPM-H)蝸牛多肽均可顯著降低H2O2引起SHSY5Y 細(xì)胞毒性。

圖2 MTT 法檢測H2O2及SPM 處理后的SH-SY5Y 細(xì)胞存活率Fig.2 Viability of SH-SY5Y cells in seven groups

2.3 Hoechst 染色檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果

Hoechst33342 染色結(jié)果顯示，正常對照組細(xì)胞核呈彌漫均勻的低強(qiáng)度熒光，凋亡率僅為3.5%;1.54 mmol/L H2O2處理SH-SY5Y 細(xì)胞24 h 后，SHSY5Y 細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的凋亡特征，如細(xì)胞質(zhì)濃縮、細(xì)胞核碎裂等，凋亡率高達(dá)(58.39 ±8.67)%;SPM-L(1.54 mmol/L H2O2+39 mg/L SPM)組和SPM-H(1.54 mmol/L H2O2+156 mg/L SPM)凋亡率分別為(44.06 ± 4.35)% 和(32.45 ± 9.44)%，提示SPM-H 能使H2O2引起的具有凋亡特征的細(xì)胞數(shù)目明顯減少，與H2O2組比較差異有顯著性意義(t=4.312，P=0.013)，見圖3。

圖3 Hoechst 染色觀察3 組間SH-SY5Y 細(xì)胞凋亡的結(jié)果(×200)Fig.3 The results of SH-SY5Y cell apoptosis of three groups by Hoechst staining (×200)

2.4 SH-SY5Y 細(xì)胞PCNA 的表達(dá)結(jié)果

PCNA 表達(dá)于細(xì)胞核中，染色陽性信號呈棕黃色。與正常對照組相比，H2O2組SH-SY5Y 細(xì)胞PCNA 的表達(dá)明顯減少;SPM-L 組和SPM-H 組PCNA表達(dá)顯色則較H2O2組明顯增強(qiáng)，呈強(qiáng)陽性染色，且陽性細(xì)胞數(shù)明顯增加。見圖4。

2.5 Western blot 檢測SH-SY5Y 細(xì)胞PCNA 的表達(dá)結(jié)果

由圖5 可見，H2O2組SH-SY5Y 細(xì)胞PCNA 的表達(dá)明顯較正常對照組減少;而SPM-L 組和SPM-H 組細(xì)胞中PCNA 表達(dá)均較H2O2組明顯升高，即呈劑量依賴性，與H2O2組比較差異有顯著性意義(P＜0.05)。

3 討論

圖4 免疫組化檢測PCNA 在4 組SH-SY5Y 細(xì)胞中的表達(dá)(×200)Fig.4 The expression of PCNA in the SH-SY5Y cell of four groups by immunochemistry (×200)

圖5 4 組SH-SY5Y 細(xì)胞中PCNA 蛋白質(zhì)的表達(dá)結(jié)果Fig.5 Expression of PCNA in SH-SY5Y cells of four groups

腦神經(jīng)元損傷的機(jī)制包括自由基損傷、細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載和炎癥反應(yīng)等。腦神經(jīng)元損傷是由自由基損傷環(huán)節(jié)觸發(fā)，鈣離子超載為中間環(huán)節(jié)，炎癥反應(yīng)為最終通路的級聯(lián)反應(yīng)。氧化應(yīng)激誘發(fā)的自由基損傷是導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡的基本原因之一，因此抗氧化是保護(hù)神經(jīng)元的有效途徑。H2O2是氧化應(yīng)激反應(yīng)密切相關(guān)的活性氧之一，其主要產(chǎn)物具有很強(qiáng)的氧化性并可自由進(jìn)入細(xì)胞，在許多神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)模型中可引起細(xì)胞損傷，且許多中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病都涉及到氧化應(yīng)激損傷［7］。研究證明，用1.54 mmol/L H2O2處理SH-SY5Y 細(xì)胞，可以引起細(xì)胞存活率降低，細(xì)胞凋亡等改變。

增殖細(xì)胞核抗原PCNA 是DNA 聚合酶δ 的輔助蛋白，參與調(diào)節(jié)DNA 的合成，與細(xì)胞的增殖周期密切相關(guān)。PCNA 是伴隨細(xì)胞增殖而表達(dá)的一種核內(nèi)蛋白，可作為一項(xiàng)評估細(xì)胞增殖狀態(tài)的指標(biāo)。Savio 等［8］對靜止的纖維母細(xì)胞應(yīng)用甲磺酸甲酯和H2O2處理后，發(fā)現(xiàn)與細(xì)胞核結(jié)合的PCNA 呈劑量依賴性增加，說明在靜止期細(xì)胞PCNA 同樣參與了受損DNA 的堿基修復(fù)過程［9］;通過將1 周齡的小鼠海馬腦片進(jìn)行培養(yǎng)，并接受紫外線照射損傷后，發(fā)現(xiàn)能誘導(dǎo)CA3 區(qū)錐體細(xì)胞PCNA 表達(dá)增高，說明在神經(jīng)系統(tǒng)中非增生細(xì)胞PCNA 的表達(dá)與DNA 的損傷修復(fù)有關(guān);研究發(fā)現(xiàn)，用1.54 mmol/L H2O2處理SHSY5Y 細(xì)胞，細(xì)胞凋亡調(diào)控因子PCNA 的表達(dá)較正常對照組明顯減少，而SPM 處理后的SH-SY5Y 細(xì)胞PCNA 明顯增加，我們認(rèn)為SPM 可能是通過改善DNA 的修復(fù)和細(xì)胞凋亡，增加細(xì)胞核PCNA 表達(dá)，從而抑制SH-SY5Y 細(xì)胞氧化損傷，起到抗氧化作用。

《本草綱目》中記載，蝸牛具有調(diào)節(jié)機(jī)體功能、促進(jìn)人體新陳代謝、增強(qiáng)細(xì)胞活力及提高機(jī)體免疫力，對糖尿病、高血壓、高血脂、惡瘡和癌癥等疾病有輔助治療作用。研究發(fā)現(xiàn)，蝸牛提取物通過干擾病毒吸附和穿入宿主細(xì)胞等機(jī)制明顯抑制HBV 復(fù)制的作用，且無細(xì)胞毒性［10］。Tsoutsos D 等［4］采用蝸牛提取物用于治療開放性創(chuàng)傷和面部深度燙傷，發(fā)現(xiàn)蝸牛提取物可以促進(jìn)開放性創(chuàng)傷和深度燙傷的皮膚愈合，提示蝸牛提取物中某些成分可促進(jìn)組織細(xì)胞修復(fù)和再生。研究發(fā)現(xiàn)，無論是低劑量還是高劑量的SPM 均具有抗氧化作用，在(39～156)mg/L 范圍內(nèi)呈濃度依賴性的抑制H2O2引起的細(xì)胞毒性作用，并且可明顯提高細(xì)胞的存活率，顯著降低H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，提示SPM 具有神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用，能對抗H2O2引起的細(xì)胞凋亡。

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