蒲 霞，郭慶喜，任美萍，楊成萬(wàn)，龍漢安*

1瀘州醫(yī)學(xué)院病理教研室;2 瀘州醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室 瀘州 646000

綠茶在我國(guó)有著悠久的種植和飲用歷史，其主要成分是茶多酚，而茶多酚中大部分為兒茶素(catechin)，其中表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯［(-)epigallocatechin-3-gallate，EGCG］含量最高，是綠茶最主要的功效成分［1］。最近的研究表明，EGCG 不僅具有抗菌、抗病毒、抗氧化、降血糖、神經(jīng)保護(hù)等多種生物學(xué)活性和藥理作用，而且還對(duì)多種腫瘤具有抑制作用［2，3］，但具體作用機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)選擇在人肝癌細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要作用的Survivin和P53 進(jìn)行研究，旨在探討EGCG 對(duì)體外培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞凋亡的作用及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721 購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生物研究所細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2 主要試劑與儀器

EGCG 標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自Sigma 公司;流式細(xì)胞儀凋亡試劑盒Annexin V-FITC Kit 購(gòu)自BECKMAN 公司;免疫細(xì)胞化學(xué)試劑購(gòu)自美國(guó)Bioworld Technology公司;RT-PCR 相關(guān)試劑購(gòu)自北京天根科技有限公司;PCR 引物購(gòu)自上海生工生物工程有限公司;主要實(shí)驗(yàn)儀器包括Binary HPLC Pump 高壓液相色譜儀(JEOL)、德國(guó)BT8100 液相色譜分析儀、美國(guó)Beckman Coulter 流式細(xì)胞儀、德國(guó)Eppendorf PCR儀等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 EGCG 單體的制備

將商品茶多酚溶解于pH 4.0(檸檬酸酸化)的蒸餾水，再加入三倍于蒸餾水的乙酸乙酯，振蕩搖勻混合液，靜置。約10 min 后，溶液分層，上層棕色溶液即為第一次萃取的酯層。重復(fù)萃取兩次，過(guò)濾酯層，用制備色譜流動(dòng)相將得到的濾液配制成一定濃度的制備樣品溶液，進(jìn)色譜柱收集相應(yīng)餾分，餾分再經(jīng)P-1 大孔樹(shù)脂吸附脫溶劑，低沸點(diǎn)無(wú)毒溶劑洗脫，相應(yīng)低沸點(diǎn)組分經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮(溫度控制在25℃，真空度為1 kPa)，濃縮液冷凍干燥后，得到EGCG 白色粉末。經(jīng)外標(biāo)法測(cè)定［4］，所得EGCG 單體濃度達(dá)98.6%。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

SMMC-7721 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%特級(jí)胎牛血清、鏈霉素和青霉素各100 U/mL、pH 7.3 的DMEM 培養(yǎng)液，37 ℃，飽和濕度，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每日倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)情況，約3 d 傳代一次。

1.2.3 流式細(xì)胞儀Annexin V-FITC/PI 法檢測(cè)肝癌細(xì)胞的凋亡情況

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SMMC-7721 細(xì)胞以2.0 ×105個(gè)/mL 的濃度接種于6 孔板，每孔2 mL，待細(xì)胞貼壁后參照既往實(shí)驗(yàn)［5］加入EGCG，分為對(duì)照組(0 μg/mL)、EGCG 低濃度組(32 μg/mL)、EGCG 高濃度組(128 μg/mL)。孵育48 h 后用0.25%的胰蛋白酶消化，吹打細(xì)胞為單細(xì)胞懸液。用4 ℃PBS 液洗滌細(xì)胞兩次，4 ℃下1000 rpm 離心5 min，棄上清。100 μL PBS 液重懸細(xì)胞，使細(xì)胞密度為5 ×105～5×106個(gè)/mL，放置冰盒上。每100 μL 細(xì)胞懸液中加入Annexin V-FITC 5μL 和PI(0.25 mg/mL)2.5 μL，300 μL 結(jié)合緩沖液，輕柔混勻，冰上避光孵育10 min 后上機(jī)測(cè)定分析。此外制備A 孔為正常待測(cè)細(xì)胞，B 孔正常待測(cè)細(xì)胞中加入1 mL 3%多聚甲醛(PFA)PBS 固定，冰上孵育30 min 后離心，100 μL PBS 液重懸。A、B 孔加入PI(0.2 mg/mL)2.5 μL，300 μL 結(jié)合緩沖液。視A 孔為正常細(xì)胞，B 孔為死亡細(xì)胞，調(diào)節(jié)適合的補(bǔ)償參數(shù)，完成凋亡檢測(cè)前的參數(shù)設(shè)定，上機(jī)測(cè)定。

1.2.4 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)SMMC-7721 細(xì)胞Survivin、P53 蛋白表達(dá)

將SMMC-7721 細(xì)胞以1.0 ×105個(gè)/mL 接種于12 孔培養(yǎng)板中，每孔1 mL，待細(xì)胞貼壁后分別加入終濃度為0、32、128 μmol/L 的EGCG 培養(yǎng)48 h 后終止培養(yǎng)。取出細(xì)胞爬片，按免疫細(xì)胞化學(xué)SABC法進(jìn)行Survivin、突變型P53 標(biāo)記，DAB 顯色，蘇木精復(fù)染，乙醇梯度脫水，封片，光鏡觀察。以試劑提供的陽(yáng)性表達(dá)切片作陽(yáng)性對(duì)照，以PBS 代替第一抗為陰性對(duì)照。陽(yáng)性顯色為棕黃色顆粒，Survivin 陽(yáng)性表達(dá)于胞漿，P53 陽(yáng)性表達(dá)于細(xì)胞核。高倍視野下(×400)隨機(jī)選取圖像，運(yùn)用Image Pro Plus 6.0 軟件分析Survivin、P53 陽(yáng)性表達(dá)的積分光密度(Integral Optical Density，IOD)值。

1.2.5 RT-PCR 檢測(cè)SMMC-7721 細(xì)胞Survivin、P53 mRNA 表達(dá)

用Oligo 6.71 Pemo 引物設(shè)計(jì)軟件，設(shè)計(jì)目的基因Survivin、突變型P53 及內(nèi)參GAPDH 特異性引物。

Survivin 上游引物:5’-CCTGGCAGCCCTTTCTCA-3’

下游引物:5’-TCAGTGGGGCAGTGGATG-3’

突變型P53 上游引物:5’-CGTGTTTGTGCCTGTCCT-3’

下游引物:5’-TGCTCGCTTAGTGCTCCCT-3’

GAPDH 上 游 引 物:5’-ATGCTGGCGCTGAGTACGTC-3’

下游引物:5’-GGTCATGAGTCCTTCCACGATA-3’

SMMC-7721 細(xì)胞以2.0 ×105個(gè)/mL 接種于6孔培養(yǎng)板中，每孔2 mL，待細(xì)胞貼壁后分別加入終濃度0、32、128 μmol/L 的EGCG 培養(yǎng)48 h 后終止培養(yǎng)。按照RNA simple Total RNA Kit 試劑盒說(shuō)明提取細(xì)胞總RNA，并驗(yàn)證總RNA 完整性及總RNA樣品純度和濃度后，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，PCR 擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，取5 μL PCR 產(chǎn)物在1.6%瓊脂糖凝膠中以100 mv 恒壓電泳45 min，在紫外線凝膠成像系統(tǒng)成像，使用BIO-RAD Quantity One 4.6 軟件分析DNA條帶，并與內(nèi)參GAPDH 吸光值比較，得到目的基因mRNA 的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié)果采用SPSS16.0 軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，檢測(cè)結(jié)果經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)，組間兩兩比較采用單因素方差分析(One Way Anova)SNK 法，以P＜0.05 視為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)肝癌細(xì)胞的凋亡

流式細(xì)胞儀檢測(cè)，EGCG 各實(shí)驗(yàn)組凋亡均增加，其凋亡指數(shù)(%)與對(duì)照組相比差異有顯著性。散點(diǎn)圖上可見(jiàn)代表凋亡細(xì)胞的右下象限細(xì)胞數(shù)隨EGCG 濃度增高而明顯增加，見(jiàn)表1、圖1。結(jié)果顯示綠茶提取物EGCG 單體對(duì)人肝癌SMMC-7721 細(xì)胞的凋亡有明顯誘導(dǎo)作用。

表1 不同濃度EGCG 對(duì)人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721 凋亡的影響(，n=6)Table 1 The effect of EGCG on the apoptosis of SMMC-7721 cells in vitro (，n=6)

表1 不同濃度EGCG 對(duì)人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721 凋亡的影響(，n=6)Table 1 The effect of EGCG on the apoptosis of SMMC-7721 cells in vitro (，n=6)

圖1 EGCG 對(duì)SMMC-7721 凋亡的影響(，n=6)Fig.1 The apoptosis of SMMC-7721 cells treated with EGCG

2.2 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)SMMC-7721 細(xì)胞中Survivin、P53 蛋白表達(dá)

隨著EGCG 濃度的增加，SMMC-7721 細(xì)胞中Survivin、突變型P53 的蛋白表達(dá)降低。見(jiàn)表2。

表2 EGCG 對(duì)SMMC-7721 細(xì)胞中Survivin、P53 蛋白表達(dá)的影響(，n=10)Table 2 The expression of Survivin and P53 proteins in SMMC-7721 cells treated with EGCG (，n=10)

表2 EGCG 對(duì)SMMC-7721 細(xì)胞中Survivin、P53 蛋白表達(dá)的影響(，n=10)Table 2 The expression of Survivin and P53 proteins in SMMC-7721 cells treated with EGCG (，n=10)

注:與對(duì)照組相比，▲P＜0.05;與32 μg/mL 組比較，★P＜0.05。Note:Compare with control，▲P＜0.05;compare with 32 μg/mL group，★P＜0.05.

2.3 RT-PCR 檢測(cè)SMMC-7721 細(xì)胞中Survivin、P53 mRNA 表達(dá)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，EGCG 能下調(diào)Survivin mRNA、P53 mRNA 表達(dá)，而且隨著藥物劑量的增加，下調(diào)趨勢(shì)更加明顯(P＜0.05)。見(jiàn)表3，圖2。

表3 EGCG 對(duì)Survivin、P53mRNA 表達(dá)的影響(，n=6)Table 3 The expression of Survivin and P53 mRNA in SMMC-7721 cells treated with EGCG (，n=6)

表3 EGCG 對(duì)Survivin、P53mRNA 表達(dá)的影響(，n=6)Table 3 The expression of Survivin and P53 mRNA in SMMC-7721 cells treated with EGCG (，n=6)

注:與對(duì)照組相比，▲P＜0.05;與32 μg/mL 組比較，★P＜0.05。Note:Compare with control，▲P＜0.05;compare with 32 μg/mL group，★P＜0.05.

圖2 EGCG 對(duì)突變型Survivin mRNA、P53 mRNA 表達(dá)的影響Fig.2 The expression of Survivin and P53 mRNA in SMMC-7721 cells treated with EGCG

3 討論

肝細(xì)胞肝癌在我國(guó)具有較高的發(fā)病率和死亡率，一直是腫瘤治療研究的重點(diǎn)之一，尋找價(jià)廉易得低毒副作用的植物藥也一直是腫瘤治療的重要方向。綠茶提取物經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)對(duì)肝細(xì)胞肝癌具有抑制作用［6］，但具體作用機(jī)制不明，制約了綠茶提取物EGCG 運(yùn)用于臨床肝癌治療的前景。本實(shí)驗(yàn)旨在探討EGCG 對(duì)體外培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞凋亡的作用和其可能的機(jī)制，為EGCG 運(yùn)用于臨床抗肝癌治療提供更多實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

Survivin 是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proteins，IAP)家族中分子量最小的蛋白，分子結(jié)構(gòu)由一個(gè)N 端的BIR 結(jié)構(gòu)域和一個(gè)長(zhǎng)的C 端(螺旋結(jié)構(gòu)組成，其中BIR 結(jié)構(gòu)域被認(rèn)為是Survivin 發(fā)揮抗凋亡作用的關(guān)鍵部位［7］。正常情況下Survivin 僅在胚胎組織中高表達(dá)，且其表達(dá)還具有細(xì)胞周期依賴性，在細(xì)胞周期G2/M 期高表達(dá)，能夠精確調(diào)控姐妹染色體的分離。同時(shí)，Survivin 可以通過(guò)線粒體途徑和死亡受體途徑，最終作用于Caspase-3 和Caspase-7 起到抗凋亡作用。也可能通過(guò)阻斷Caspase-9 依賴的細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)起到間接抗凋亡作用。有大量的研究表明Survivin 在大多數(shù)的癌組織中有不同程度的表達(dá)，并且Survivin 的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡減少，與腫瘤的臨床分期、組織分化等具有相關(guān)性。由于Survivin 基因表達(dá)特異性強(qiáng)，在腫瘤組織中表達(dá)率高，因此成為了腫瘤基因治療的理想靶點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，在人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721 凋亡增加的過(guò)程中，的確存在Survivin 基因的表達(dá)抑制，這一結(jié)果與既往實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致［8］。因此可以推測(cè)綠茶提取物EGCG 可以作用于Survivin 基因，通過(guò)抑制Survivin 基因的表達(dá)達(dá)到誘導(dǎo)凋亡的目的。

野生型的P53 基因具有重要的抑癌作用，主要通過(guò)檢測(cè)G1 和G2/M 期校正點(diǎn)并阻滯細(xì)胞周期、抑制腫瘤血管生成和促進(jìn)細(xì)胞凋亡等發(fā)揮作用。其中抑制Survivin 的表達(dá)可能是野生型P53 促進(jìn)細(xì)胞凋亡的主要途徑，但抑制表達(dá)的機(jī)制復(fù)雜，目前尚無(wú)定論。大多數(shù)人認(rèn)為野生型P53 可與Survivin 啟動(dòng)子結(jié)合，從而抑制Survivin 表達(dá)。Survivin 表達(dá)與P53 狀態(tài)及啟動(dòng)子多態(tài)性有關(guān)，也有研究認(rèn)為P53與Survivin 外顯子去甲基化狀態(tài)有關(guān)。當(dāng)野生型P53 發(fā)生基因缺失、雜合和(或)突變時(shí)，將對(duì)機(jī)體產(chǎn)生不同程度的影響。比如由于突變型的P53 缺乏在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)Survivin 表達(dá)的抑制，會(huì)使得Survivin 過(guò)度表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。已有的研究表明，人類大多數(shù)腫瘤都存在P53 基因的突變，并且Survivin 和突變型P53 表達(dá)具有相關(guān)性，對(duì)抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡起著協(xié)同作用。下調(diào)Survivin 和突變型P53 表達(dá)可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡并使腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)有絲分裂阻滯而抑制增殖［9］。Chang 等［10］也 認(rèn) 為，當(dāng)p38MAPK-p53-survivin 信號(hào)通路受到抑制時(shí)可以誘導(dǎo)人結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT116 的凋亡。以上實(shí)驗(yàn)均證明，通過(guò)抑制Survivin 或突變型P53 的表達(dá)，可以達(dá)到誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。

綜上所述，Survivin 和突變型P53 都在腫瘤細(xì)胞的凋亡過(guò)程中起到了重要的作用，而綠茶提取物EGCG 可以通過(guò)抑制Survivin 和突變型P53 的表達(dá)，誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721 凋亡，進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤作用。

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