申義君，王 斌，周金偉，沈留紅，余樹民，彭廣能，曹隨忠

四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 動(dòng)物疫病與人類健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，雅安 625014

黃芪(Radix astragali)是傳統(tǒng)補(bǔ)氣中藥，具有補(bǔ)氣益衛(wèi)、托毒生肌、補(bǔ)虛升陽之功效。黃芪多糖(Astragalus polysaccharide，APS)是黃芪中含量最多，免疫活性最強(qiáng)的水溶性復(fù)合植物多糖［5，6］。現(xiàn)代藥理研究證明APS 具有增強(qiáng)免疫力，有效的增強(qiáng)細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)，對(duì)疫苗有輔助增效的作用［5-7］。目前APS 作為免疫增強(qiáng)劑在雞和小鼠方面的應(yīng)用研究較多，張訓(xùn)海等［8］研究發(fā)現(xiàn)APS 能增強(qiáng)機(jī)體的體液免疫，顯著提高新城疫抗體效價(jià)。關(guān)于APS 是否能提高奶牛對(duì)口蹄疫疫苗應(yīng)答能力，目前還鮮見報(bào)道。本試驗(yàn)通過對(duì)奶牛日糧中添加APS 探討APS 對(duì)奶牛口蹄疫疫苗免疫抗體水平的影響，以期為天然免疫增強(qiáng)劑的開發(fā)和應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)藥品

APS 購自愛迪森(北京)生物科技有限公司(批號(hào):1208041，純度:每1 g 含黃芪多糖以葡萄糖計(jì)為564 mg;每1 g 黃芪多糖粉相當(dāng)于原生藥7 g)，為黃色精細(xì)粉末?？谔阋卟《綩 型、亞洲I 型二價(jià)滅活苗購自新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司(生產(chǎn)批號(hào):2012007)。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

年齡、胎次和體重相近的健康荷斯坦奶牛40頭，由四川雅安滎經(jīng)縣新世紀(jì)生態(tài)乳業(yè)有限公司提供。

1.1.3 儀器與試劑

Varioskan Flash 全波長多功能酶標(biāo)儀(美國)，超純水儀(型號(hào)MILLPAK20，美國)，8 道移液槍?？谔阋邅喼蔻裥涂贵w液相阻斷ELISA 檢測(cè)試劑盒(批號(hào):2012111302);口蹄疫O 型抗體液相阻斷ELISA 檢測(cè)試劑盒(批號(hào):2012111601)，以上試劑盒均購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組與處理

（3）結(jié)果：將脫氧烏頭堿水溶液加熱不同時(shí)間的樣品進(jìn)行HPLC檢測(cè)，色譜圖進(jìn)行對(duì)比，篩選出變化較為明顯的色譜圖（圖6）進(jìn)行分析。

將40 頭年齡、胎次和體重相近的健康荷斯坦奶牛隨機(jī)分為4 組(每組10 頭)，分別為空白對(duì)照組、APS 低劑量(5 g/頭·d)、中劑量(10 g/頭·d)、高劑量(15 g/頭·d)組。在常規(guī)飼養(yǎng)的基礎(chǔ)上，3個(gè)試驗(yàn)組分別將5、10、15 g 劑量的APS 粉拌入精料飼喂，每天1 次，連續(xù)給藥7 d;空白對(duì)照組按照同樣方法飼喂。給藥第4 d 所有奶牛進(jìn)行口蹄疫免疫，每頭注射疫苗2 mL。

1.2.2 飼養(yǎng)管理

各組試驗(yàn)?zāi)膛５娘曫B(yǎng)管理?xiàng)l件相同，在開放式固定槽位栓系飼養(yǎng)，統(tǒng)一定時(shí)定量定質(zhì)飼喂，自由飲水。

1.2.3 血樣采集

分別于給藥第0、4、18、32、46 d 和104 d 上午9∶00～10∶00 對(duì)所有試驗(yàn)?zāi)膛＿M(jìn)行尾根靜脈采血，分離血清，-20 ℃保存待檢。

1.2.4 抗體檢測(cè)及方法

采用液相阻斷ELISA 試劑盒分別檢測(cè)第0、4、18、32、46 和104 d 時(shí)血清中口蹄疫抗體水平。具體檢測(cè)方法和步驟參照試劑盒說明書進(jìn)行。嚴(yán)格按照試劑盒檢測(cè)方法和步驟進(jìn)行具體步驟如下:1.包被ELISA 板，充分混勻濕盒中室溫過夜;2.抗原抗體反應(yīng)，血清1∶4 開始做2 倍連續(xù)稀釋至1∶512，同時(shí)稀釋陰陽性對(duì)照血清，之后每孔中加入稀釋好的抗原，震蕩混勻，封板，4 ℃過夜;3.洗滌ELISA 板后將抗原抗體反應(yīng)中對(duì)應(yīng)各孔中的血清病毒混合物按次序轉(zhuǎn)移至ELISA 板上，37 ℃溫育1 h;4.洗滌ELISA板，將稀釋好的豚鼠抗口蹄疫病毒血清加入到ELISA 板中，37 ℃溫育1 h;5.洗滌ELISA 板，將稀釋好的兔抗豚鼠酶結(jié)合物加入到ELISA 板中37 ℃溫育1 h;6.洗滌ELISA 板，加入底物37 ℃溫育15 min 后加入終止液，立即在492 nm 波長下讀取吸光值。

1.2.5 檢測(cè)結(jié)果的判定

嚴(yán)格按液相阻斷ELISA 試劑盒說明書進(jìn)行。被檢血清稀釋孔D492nm的吸光值大于臨界值的孔為陰性孔，小于或等于臨界值的孔為陽性孔，陽性孔在D492nm的吸光值等于臨界值所對(duì)應(yīng)的稀釋度為該份血清的抗體滴度。若臨界值在兩個(gè)滴度之間，抗體滴度則取中間值;抗體效價(jià)≥1∶l28，保護(hù)率99%以上;抗體效價(jià)在1∶22～1∶90，保護(hù)率50%;抗體效價(jià)≤1∶16，不保護(hù)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS19.0 軟件應(yīng)用one-way ANOVA 選擇LSD 法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，結(jié)果用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(D)表示，以P＜0.05 作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃芪多糖對(duì)亞洲Ⅰ型口蹄疫抗體水平的影響

試驗(yàn)初期各喂藥組與對(duì)照組亞洲Ⅰ型口蹄疫抗體水平差異不顯著(P ＞0.05);接種疫苗后各組奶牛口蹄疫的抗體水平均增高，各組的保護(hù)率均達(dá)到99%。對(duì)照組抗體水平先達(dá)到峰值，而此時(shí)喂藥組抗體水平仍有上升趨勢(shì)，較晚到達(dá)峰值。各喂藥組的抗體水平相對(duì)與對(duì)照組抗體水平下降趨勢(shì)較緩和，且試驗(yàn)第25 d 時(shí)各喂藥組亞洲Ⅰ型抗體水平已高于對(duì)照組。試驗(yàn)第32～104 d 各喂藥組亞洲Ⅰ型口蹄疫抗體效價(jià)顯著的高于對(duì)照組(P＜0.05)，其中低劑量組高于對(duì)照組1個(gè)滴度左右，中劑量組和高劑量組高于對(duì)照組1個(gè)滴度以上;在46 d 時(shí)對(duì)照組保護(hù)率已降低到80%。結(jié)果表明，APS 能延長亞洲Ⅰ型口蹄疫的抗體效價(jià)的平臺(tái)期，而在衰退期使亞洲Ⅰ型口蹄疫的抗體保持在高位水平，從而增強(qiáng)口蹄疫疫苗的保護(hù)力度。

圖1 APS 對(duì)血清FMD 抗體效價(jià)的影響(亞洲Ⅰ型)Fig.1 Effects of APS on serum FMD antibody titer (type Asia I)

2.2 黃芪多糖對(duì)O 型口蹄疫抗體水平的影響

試驗(yàn)初期各喂藥組與對(duì)照組O 型口蹄疫抗體水平差異不顯著(P ＞0.05);接種疫苗后各組奶牛O 型口蹄疫抗體水平均增高，各組的保護(hù)率都達(dá)到99%。試驗(yàn)第32～104 d 時(shí)，APS 中、高劑量組的O型口蹄疫的抗體效價(jià)顯著高于空白對(duì)照組(P＜0.05)，且在此時(shí)間段內(nèi)APS 中、高劑量組O 型抗體水平高于對(duì)照組一個(gè)滴度以上，而APS 低劑量組僅在第32～46 d O 型口蹄疫的抗體效價(jià)顯著高于空白對(duì)照組(P＜0.05)其中在第46 d 時(shí)APS 低劑量組O 型口蹄疫抗體水平高于對(duì)照組一個(gè)滴度以上。結(jié)果表明，APS 能夠延長O 型口蹄疫抗體效價(jià)的平臺(tái)期，有效的延緩抗體效價(jià)進(jìn)入衰退期。

圖3 APS 對(duì)血清FMD 抗體效價(jià)的影響(O 型)Fig.3 Effects of APS on serum FMD antibody titer (type O)

圖4 APS 對(duì)FMD 保護(hù)率的影響(O 型)Fig.4 Effects of APS on protection rates against FMD (type O)

3 討論

免疫增強(qiáng)劑能增強(qiáng)機(jī)體抗病力降低機(jī)體對(duì)有害微生物的易感性以及防止動(dòng)物發(fā)生免疫抑制。大量藥理及臨床研究表明，多糖類化合物是良好的免疫調(diào)節(jié)劑，尤其是植物(板藍(lán)根、玉米花粉、黃芪、香菇、海藻等)多糖具有治療的廣譜性及相對(duì)低毒性，它能激活免疫細(xì)胞，提高機(jī)體免疫功能，其作用具有多途徑、多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)等特點(diǎn)，適合作為免疫增強(qiáng)劑［3］。

APS 能促進(jìn)T 細(xì)胞轉(zhuǎn)化和增殖，激發(fā)T 淋巴細(xì)胞和B 淋巴細(xì)胞的功能，使脾內(nèi)效應(yīng)B 細(xì)胞增生，促進(jìn)抗體的合成，增強(qiáng)體液免疫［8］。項(xiàng)杰等［9］發(fā)現(xiàn)黃芪多糖能夠促進(jìn)B 細(xì)胞的活化、增殖、產(chǎn)生抗體提高小鼠血清抗體滴度，增強(qiáng)宿主的體液免疫來保護(hù)宿主抵抗胞內(nèi)菌的感染。邱妍等［10］通過對(duì)雛雞應(yīng)用一定劑量的黃芪多糖，能顯著提高新城疫疫苗和雞新城疫和雞傳染性支氣管炎二聯(lián)苗的免疫效果。王學(xué)斌等［6］研究發(fā)現(xiàn)黃芪多糖粉劑、黃芪多糖注射液對(duì)雛雞均有較好的免疫增強(qiáng)作用，均能提高雛雞體內(nèi)新城疫抗體效價(jià)。

體液免疫是機(jī)體抗御傳染病的主要因素之一，在體內(nèi)可發(fā)揮多種免疫功能，是機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要組成部分?？贵w滴度的高低直接反應(yīng)機(jī)體的體液免疫狀態(tài)，是評(píng)估其免疫狀況的重要指標(biāo)，因此本試驗(yàn)采用檢測(cè)抗體滴度作為評(píng)價(jià)黃芪多糖增強(qiáng)口蹄疫疫苗免疫效果的指標(biāo)。免疫增強(qiáng)劑能夠促進(jìn)抗體的產(chǎn)生，延緩抗體的下降或消失。奶牛接種口蹄疫疫苗后發(fā)揮免疫作用的有T 細(xì)胞、B 細(xì)胞，這些免疫細(xì)胞受到抗原刺激后能分化增殖，發(fā)生特異性免疫應(yīng)答，產(chǎn)生抗體。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出APS 能減緩抗體水平增高的速度，延長增高的時(shí)間、提高增幅、延緩抗體下降，延長口蹄疫抗體的平臺(tái)期，在衰退期使口蹄疫的抗體保持在較高滴度水平，喂藥組口蹄疫抗體滴度比對(duì)照組高1個(gè)滴度以上，且與用藥的劑量有量效關(guān)系。這與張紅英等［11］報(bào)道的山藥多糖免疫增強(qiáng)作用主要是在免疫的中后期，且一直持續(xù)到試驗(yàn)結(jié)束結(jié)果相似。APS 除具有免疫增強(qiáng)作用外，還可能與試驗(yàn)組從免疫前4 d 就開始使用黃芪多糖，提高了機(jī)體非特異性免疫，降低了接種時(shí)的應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。因此在進(jìn)行奶牛口蹄疫疫苗免疫接種前后，配合使用黃芪多糖飼喂奶牛能提高口蹄疫抗體滴度，延長抗體維持時(shí)間并且群體效價(jià)水平整齊，提高機(jī)體免疫功能，達(dá)到增強(qiáng)疫苗免疫的效果。

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